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Previous issue date: 2006 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Paracoccidioides brasiliensis é o fungo dimórfico responsável pela
paracoccidioidomicose (PCM). A diferenciação celular do P. brasiliensis de micélio para
levedura nos pulmões é essencial para a ocorrência da PCM e é dependente de temperatura.
Parte das alterações sofridas pelo fungo está provavelmente relacionada com a expressão de
proteínas de estresse (Hsp), pouco conhecidas no P. brasiliensis. Em nosso laboratório foram
clonados os genes de P. brasiliensis homólogos aos de duas proteínas mitocondriais de choque
térmico: o PbLON, da proteinase Lon, e a porção 5’ do PbMDJ1, da chaperone Hsp40/Mdj1.
Estes genes estão ligados por uma região 5’ intergênica comum (ML), o que pode ser
relevante em relação à regulação transcricional não apenas porque ambos respondem ao
estresse, mas também pela relação funcional. Mdj1p é o membro da família DnaJ localizado na
matriz mitocondrial, o qual é essencial na digestão de proteínas desnaturadas pela Lon.
Neste trabalho o gene PbMDJ1 de P. brasiliensis foi totalmente caracterizado. Sua
sequência apresenta uma ORF de 1659pb, organizada em três exons interrompidos por dois
introns. PbMdj1 apresenta 551 aminoácidos com alta similaridade com as homólogas de
Blastomyces dermatitidis, Histoplasma capsulatum e Coccidioides immitis. O alinhamento
destas sequências permitiu mapear todos os domínios que caracterizam a família da DnaJ, a
saber, um domínio J, um domínio rico em G/F e um domínio ligante de zinco organizado em
quatro repetições de CXXCXGXG. Para a expressão de PbMdj1 recombinante em bactéria, um
fragmento de cDNA de 757pb da região 5´ foi subclonado no vetor pHIS3. A proteína PbMdj1r
foi purificada e utilizada na obtenção de anticorpos policlonais de coelho. Em microscopia
eletrônica e confocal, os anticorpos anti-PbMdj1r localizaram a molécula na mitocôndria de
leveduras de P. brasiliensis Pb18, mas também abundantemente na parede celular e região de
brotamento. Em ensaios de “imunoblotting”, os anticorpos revelaram uma proteína nativa de
55 kDa tanto em extratos mitocondriais, com significativo aumento da expressão em condições
de estresse térmico, como em uma fração de parede. Sua localização extramitocondrial foi
confirmada ainda por citometria de fluxo (FACS). Alguns soros de pacientes com PCM reagiram
com a PbMdj1r em “immunoblotting”, sugerindo que os pacientes reconhecem essa proteína
durante a infecção.
Obervamos que locus cromossômico dos genes MDJ1/LON é comum entre fungos
dimórficos e Aspergillus. Na região intergênica 5’ compartilhada pelos genes MDJ1/LON de P.
brasiliensis Pb18 e Pb3 foram mapeados e validados 4 elementos de transcrição usando o
ensaio de proteção contra DNase I “footprinting” e em experimentos de retardo da mobilidade
eletroforética (EMSA). Essas regiões abrigam um elemento de choque térmico convencional,
dois não-convencionais e outro ligante de AP-1 (ARE), associado ao estresse oxidativo. Foram
encontrados motivos similares nos locus correspondente de B. dermatitidis e H. capsulatum.
O Pb3, que pertence a uma espécie críptica filogeneticamente distinta, apresentou
polimorfismo na região ML. As análises comparativas entre Pb18 e Pb3 mostraram diferenças
no número de elementos de transcrição no padrão da regulação transcripcional de PbLON e
PbMDJ1 durante a transição de fase. Em Pb18, PbMDJ1 parece ser preferencialmente expresso
na fase leveduriforme. Ambos os genes apresentaram aumento nos níveis de transcrição após
choque térmico a 42 ºC, porém em Pb3 esse efeito foi mais lento.
Este é o primeiro trabalho que detecta elementos de trancrição em P. brasiliensis e
pode contribuir significativamente para entendimento da regulação de genes de estresse em
fungos dimórficos. As diferenças detectadas em Pb18 e Pb3 quanto à regulação transcricional
dos genes aqui estudados e eventualmente outros poderá explicar a distinta relação parasitahospedeiro
que os isolados apresentam em camundongos B10.A. / Paracoccidioides brasiliensis is the dimorphic fungus responsible for
paracoccidioidomycosis in man, who is infected by inhalation of conidia. The cellular
differentiation of P. brasiliensis from mycelium (M) to yeast (Y) in the lungs is essential for
infection to occur. J-domain (DnaJ) proteins, of the Hsp40 family, are essential cofactors of
their cognate Hsp70 chaperones, besides acting as independent chaperones. In the present
study, we have cloned and sequenced the heat shock gene PbMDJ1, which encodes an Mdj1
homologue that is a mitocondrial DnaJ in yeasts. The gene sequence consists of an ORF of
1719bp interrupted by three introns and translates 551 amino acid residues. PbMdj1 is
organized in modules consisting of a J domain, followed by a glycine/phenylalanine-rich
segment and four CXXCXGXG (zinc finger) domains. The C-terminal is not conserved. We
expressed a His-tagged N-terminal region of PbMdj1 and used the recombinant protein to
immunize rabbits to obtain anti-PbMdj1r serum. Immune-localization was performed using
confocal and electron microscopy, and also flow cytometry.
We demonstrated the presence of PbMdj1 not only in the mitochondria, where it is
apparently sorted, but also in the cell wall of P. brasiliensis. Labeling was abundant
throughout the cell wall and especially in the budding regions; however, anti-PbMdj1r did not
affect fungal growth in the concentrations tested in vitro, possibly due to the poor access of
the antibodies to their target in growing cells. Labeled mitochondria stood preferentially close
to the plasma membrane and gold particles were detected in the thin space between them,
towards the cell surface. The anti-rPbMdj1 antibodies used in the reactions specifically
recognized a single 55 kDa mitochondrial and cell wall (alkaline β-mercaptoethanol extract)
component, compatible with the predicted size of the protein devoid of its matrix peptidetargeting
signal. This is the first time a DnaJ member has been observed on the cell surface,
where its function is speculative.
In the present work we show that Mdj1 and the mitochondrial proteinase Lon
homologues are heat shock proteins in the P. brasiliensis and that their gene organization is
conserved among thermodimorphic fungi and Aspergillus, where the genes are adjacent and
have a common 5´region. We mapped and validaded transcription elements in the 5´-shared
intergenic (ML) region of MDJ1/LON from P. brasiliensis using both DNAse I protection
footprinting and mobility shift assays. Three of them were similar to canonical and nonconventional
heat shock elements and one is a putative AP-1 binding domain (ARE), related to
oxidative stress. Similar motifs were detected in the correspondent locus of B. dermatitidis
and H. capsulatum. Our studies compared P. brasiliensis Pb18 with genetically distinct Pb3,
where the ML region is polymorphic outside mapped motifs. In these isolates, different
numbers of elements were detected and the pattern of mRNA accumulation of the genes was
distinct during phase transition. In Pb18, PbMDJ1 was preferentially expressed in the yeast
phase. This is the first study of transcription elements in P. brasiliensis that might help to
understand regulation of stress-related genes involved in fungal adaptation to the host. / BV UNIFESP: Teses e dissertações
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unifesp.br:11600/21211 |
| Date | January 2006 |
| Creators | Batista, Wagner Luiz [UNIFESP] |
| Contributors | Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Puccia, Rosana [UNIFESP] |
| Publisher | Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | 153 f. |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UNIFESP, instname:Universidade Federal de São Paulo, instacron:UNIFESP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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