Durch die vorliegende Arbeit wurde gezeigt, dass Rhodobacter sphaeroides das Potenzial besitzt, umweltverträglich photoheterotroph Wasserstoff als alternativer, erneuerbarer Energieträger zu erzeugen. Aus genomischen und transkriptomischen Erkenntnissen konnten Rückschlüsse auf Ansatzpunkte für weitere Optimierungen getroffen werden. Durch ein neues Minimalmedium, welches zukünftig sogar einen Beitrag zur Abfallbeseitigung leisten kann, wurde ein wichtiger Schritt hinsichtlich der industriellen Anwendbarkeit von R. sphaeroides für die biologische Wasserstoffproduktion gemacht.:Danksagung
Datenverfügbarkeit
Inhaltsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Tabellenverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
1. Einleitung
1.1 Wasserstoff
1.1.1 Wasserstoff als Energieträger
1.1.2 Herstellung von Wasserstoff
1.1.2.1 Konventionelle Wasserstoffproduktion
1.1.2.2 Biologische Wasserstoffproduktion
1.1.2.3 Biologische Wasserstoffproduktion aus Abfällen
1.2 Photosynthetische Bakterien
1.2.1 Rhodobacter sphaeroides im Kontext der biologischen Wasserstoffproduktion
1.2.2 An der Wasserstoffproduktion beteiligte Enzyme
1.3 Third Generation-Sequencing Technologien
2. Zielstellung
3. Material
3.1 Chemikalien
3.2 Medien und Pufferlösungen
3.2.1 Van Niel´s Yeast Medium
3.2.2 Medium nach Krujatz et al. (2014)
3.2.3 RÄ-Medium nach Mougiakos et al. (2019)
3.2.4 PY (Peptone Yeast) Agarmedium
3.2.5 2x YT Medium
3.2.6 LB Medium
3.2.7 GYCC Medium
3.2.8 SOB Medium
3.2.9 SOC Medium
3.2.10 Pufferlösungen
3.3 Mikroorganismen
3.4 Molekularbiologische Reagenzien und Primer
3.5 Plasmide
3.5.1 pCas9
3.5.2 pRKPOL2
3.5.3 pSUPPOL2Sca
3.5.4 pBBRBB-Ppuf843-1200-DsRed
3.5.5 pBBR_cas9_NT
3.6 Geräte
4. Methoden
4.1 Rhodobacter sphaeroides Dauerkultur in Van Niel´s Yeast Medium 112 (ohne Wasserstoffproduktion)
4.2 Rhodobacter sphaeroides Batch-Kultivierung
4.2.1 Kultivierung in Medium nach Krujatz et al. (2014); Vollmedium mit Wasserstoffproduktion
4.2.2 Kultivierung in Fruchtsaftmedium
4.3 Rhodobacter sphaeroides Kultivierung mit kontinuierlicher Aufzeichnung von Temperatur, pH, optischer Dichte, Wasserstoffproduktion und Gasanalyse
4.4 Zellernte
4.5 Nukleinsäureextraktion mit dem MasterPureTM Complete RNA and DNA Purification Kit
4.6 DNase-Abbau
4.7 RNase-Abbau
4.8 Qualitätskontrolle der RNA und DNA mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer
4.9 Reverse Transkription und Probenaufreinigung
4.10 qRT-Polymerasekettenreaktion
4.11 Etablierung der CRISPR-Cas9- Methodik bei Rhodobacter sphaeroides – Gen-Knockout der Hydrogenase Untereinheit hupL mit CRISPR-Cas9
4.11.1 Anzucht der Escherichia coli Stämme mit und ohne Plasmid
4.11.2 Plasmid Extraktion mit GeneJET Plasmid Miniprep Kit (#K0502, Thermo Scientific)
4.11.3 Restriktionsverdau zur Vektorlinearisierung
4.11.4 Design der guideRNA
4.11.5 Phosphorylierung der guideRNA
4.11.6 Ligation der guideRNA in pCas9
4.11.7 Transformation pCas9_hupL1/hupL2 in Escherichia coli JM109 durch chemische Kompetenz
4.11.8 Colony-PCR zum Insertnachweis hupL1&2 in pCas9 mit GoTaq® G2 Green Master Mix (Promega)
4.11.9 Konstruktion weiterer Vektoren mit CRISPR-Cas9 Maschinerie aus pCas9_hupL1/2
4.12 Genomeditierung in Rhodobacter sphaeroides
4.12.1 Transformation durch chemische Kompetenz mit PEG-Methode
4.12.2 Transformation durch chemische Kompetenz nach Hanahan et al. (1991)
4.12.3 Konjugation mit Escherichia coli S17-1
4.12.4 Elektroporation
4.12.5 Bioballistische Genomeditierung mit PDS-1000/He Particle Delivers System (BIORAD)
4.12.6 Konjugation mit Escherichia coli S17-1 nach Mougiakos et al. (2019) 65
4.13 Probenvorbereitung für Sequenzierungen
4.13.1 Illumina MiSeq (Genomsequenzierung)
4.13.2 MinION (Genomsequenzierung)
4.13.3 Illumina HiSeq (Transkriptomsequenzierung)
4.14 Bioinformatische Methoden
4.14.1 Genomsequenzierung (Re-Sequenzierung)
4.14.2 Transkriptom-Datenanalyse
5. Ergebnisse und Diskussion
5.1 Schrittweise Reduktion des Vollmediums nach Krujatz et al. (2014) zum Fruchtsaft-Minimalmedium
5.2 Untersuchung der Wasserstoffproduktion in Fruchtsaft-Minimalmedium
5.3 Kontinuierliche Aufzeichnung von Prozessdaten im 1,2 L Bioreaktor
5.3.1 Vergleich der Reaktorläufe in Vollmedium nach Krujatz et al. (2014), Trauben- und Ananas-Minimalmedium der Stämme DSM 158 und SubH2
5.3.2 Prozessgasanalyse
5.4 Analyse des Genoms
5.4.1 Multiples Sequenzalignment der kompletten genomischen Assemblies von Rhodobacter sphaeroides
5.4.2 MiSeq-Sequenzierung des Stammes Rhodobacter sphaeroides 2.4.1. SubH2
5.4.2.1 Bioinformatische Funktionsanalyse von SNPs
5.4.2.2 SNP-Analyse mittels Homology-Modeling
5.4.3 Genomische Architekturanalyse mittels MinION Sequenzierung der Rhodobacter sphaeroides Stämme DSM 158 und 2.4.1. SubH2
5.4.4 Vergleich der MiSeq- und MinION Genomanalysen
5.5 Analyse des Transkriptoms
5.6 Analyse der Genexpression mit qRT-PCR im Vergleich mit der Wasserstoffproduktion
5.7 CRISPR-Cas9 zum Plasmid-basierten hupL Knock-out
5.7.1 Erstellung der Plasmide pCas9_hupL1 und pCas9_hupL2
5.7.2 PEG-basierte Transformation nach Fornari et al. (1982)
5.7.3 Transformation mittels Elektroporation
5.7.4 Erstellung weiterer Vektoren mit CRISPR-Cas9_Maschinerie aus pCas9_hupL1&2
5.7.5 Transformation mittels Konjugation I
5.7.6 Bioballistische Transformation
5.7.7 Problembehandlung zur Transformation
5.7.8 Transformation mittels Konjugation II
6 Zusammenfassung
7 Ausblick
8 Summary
Literaturverzeichnis
Anhangsverzeichnis
Anhang
Versicherung
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:78911 |
| Date | 25 April 2022 |
| Creators | Wappler, Nadine Christina |
| Contributors | Göttfert, Michael, Wünschiers, Röbbe, Technische Universität Dresden, Hochschule Mittweida |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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