Tesis por compendio / [ES] El cultivo del caqui ha crecido enormemente en la región Valenciana
en los últimos 20 años al presentarse como una alternativa
interesante al cultivo de cítricos. Sin embargo, su cultivo se enfrenta
a tres problemas importantes. En primer lugar, su producción es
monovarietal y se centra en la variedad Rojo Brillante, lo que conlleva
un riesgo sanitario y de mercado importante que pone de manifiesto
la necesidad de aumentar el número de variedades disponibles. En
segundo lugar, el cambio climático pone en peligro la producción de
caqui en zonas mediterráneas debido a un aumento en la salinidad
del agua y suelo. La salinidad afecta especialmente al caqui debido a
sus efectos sobre la producción, calidad y postcosecha de la fruta. La
falta de patrones tolerantes a la salinidad compatibles con las
condiciones de cultivo además agrava este problema, por lo que es
necesario el desarrollo de patrones clonales tolerantes a la salinidad.
En tercer lugar, la industria del caqui está basada en la aplicación de
tratamientos postcosecha de desastringencia. Aunque existen
variedades naturalmente no astringentes, su uso en el Mediterráneo
es complicado debido a la incompatibilidad con los patrones
existentes. Además, la salinidad afecta gravemente la eficacia del
tratamiento de desastringencia. Por ello, cabe destacar que se
necesita más información acerca de los mecanismos moleculares que
controlan el desarrollo de la astringencia para poder desarrollar
nuevas variedades y/o unos tratamientos de desastringencia más
efectivos.
En el contexto de la mejora genética y la biología molecular, pueden
distinguirse tres objetivos para mejorar las condiciones de cultivo en
esta región: el desarrollo de nuevas variedades de caqui con una
época de madurez distinta a Rojo Brillante, el desarrollo de patrones
clonales tolerantes a la salinidad y compatibles con variedades no
astringentes y la obtención de nuevos conocimientos acerca de las
bases moleculares del mecanismo de regulación de la astringencia
para optimizar los tratamientos postcosecha. La presente tesis ha
contribuido a estos tres objetivos.
Respecto a la obtención de nuevas variedades, se ha desarrollado un
análisis de diversidad genética del banco de germoplasma del IVIA, lo
que es un recurso importante para la planificación de cruces. Para
asegurar una mejora genética eficiente y evitar redundancias en la
colección, se ha efectuado un análisis de diversidad usando
secuencias microsatélites. El análisis ha arrojado datos de gran
utilidad, como el descubrimiento de alelos únicos, que permiten la
identificación rápida de variedades, o la división de la colección de
acuerdo con el tipo de astringencia del fruto, confirmando el fondo
genético común de las accesiones que comparten este carácter.
Además, el mapa de las relaciones filogenéticas generado será de
gran utilidad para la planificación futura de cruces dentro del
programa de mejora de caqui.
Para abordar el problema de la salinidad, se han realizado distintos
ensayos de estrés salino en invernadero con distintas poblaciones de
especies utilizadas como patrón de caqui: Diospyros virginiana
(tolerante a salinidad), Diospyros kaki (sensible a salinidad y compatible) y Diospyros lotus (sensible a salinidad). Además, debido
a los caracteres de gran interés presentes en estas dos especies, se
incluyó en los ensayos una población proveniente de un retrocruce
entre D. kaki y D. virginiana. Como resultado, varios individuos de
estas poblaciones se han seleccionado debido a su tolerancia a la
salinidad, ya que podrían tener las características adecuadas para ser
patrones clonales. Complementariamente, se han usado
aproximaciones fisiológicas, transcriptómicas y de secuenciación
masiva de transcriptoma para hacer una primera descripción de los
mecanismos de tolerancia a la salinidad presentes en estas especies.
Como resultado, se han descrito los principales caracteres
relacionados con la tolerancia a la salinidad en el género Diospyros,
como la compartimentalización de iones, la expresión en raíz de un
gen similar a HKT-1, la abundancia de canales de cloruro o la
arquitectura de raíz.
Finalmente, para obtener más información sobre la biosíntesis de
proantocianidinas, la molécula responsable de la astringencia, se
formuló la hipótesis de la existencia de un complejo proteico del tipo
MBW (MYB-bHLH-WD40) que podía regular la ruta molecular de
forma análoga a la regulación existente en otras especies estudiadas.
En primer lugar se secuenció un gen tipo WD40, posible ortólogo de
TTG1 de Arabidopsis thaliana. El papel de este gen y otros genes del
hipotético complejo (MYB2, MYB4 y MYC1) han sido estudiados
mediante un análisis transcriptómico en distintos estadios de
madurez de frutos astringentes y no astringentes. Además, se ha
observado mediante microscopía la localización celular de estos genes mediante la expresión transitoria con fusión con fluorescencia
en hojas de Nicotiana benthamiana y hemos analizado su interacción
mediante ensayos de doble híbrido en levadura y BiFC
(complementación bimolecular de fluorescencia) mediante expresión
transitoria en hojas de Nicotiana benthamiana. Finalmente, hemos
analizado los efectos de estos genes y de sus interacciones en la ruta
de biosíntesis de proantocianidinas usando el promotor del gen ANR
(antocianidin reductasa) y promotores de los genes reguladores
MYC1 y MYB4, fusionándolos con una luciferasa como gen delator y
coexpresándolos con distintas combinaciones de los genes del
complejo MBW mediante expresión transitoria en hojas de Nicotiana
benthamiana. Los resultados de estos ensayos confirman la
interacción nuclear de estos genes y su papel en la regulación de la
producción de la astringencia, dando lugar a un modelo básico con
algunas diferencias a los propuestos en otras especies. / [EN] Persimmon culture has vastly grown in the last 20 years as an
alternative to citrus production in the Valencian region. However, its
production faces three important problems. First, monovarietal
production based on Rojo Brillante is a sanitary and market risk that
requires to increase the number of varieties available. Second,
climate change has threatened persimmon production in the
Mediterranean areas because the salinity increase in water and soil.
Salinity severely affects production, quality and postharvest life of
the fruit. The lack of salt-tolerant rootstocks compatible with the
cultural conditions aggravates the problem; hence clonal salt-tolerant
rootstocks are needed. Third, persimmon industry relies on the
postharvest deastringency treatment of the varieties. Even though
there are varieties that are naturally non-astringent, its culture in the
Mediterranean area is limited due to rootstock incompatibility.
Additionally, the costly postharvest treatment is also affected by
salinity. Consequently, more information is needed about the
molecular mechanism of astringency biosynthesis in persimmon fruit
in order to develop new varieties and/or more effective treatments
for removing astringency of the fruit.
In the context of breeding and molecular biology, three goals need to
be approached in order to improve the cultural conditions:
development of new persimmon varieties with maturity date
different from Rojo Brillante, development of salt-tolerant clonal
rootstocks compatible with non-astringent varieties and research on the molecular bases of the mechanism of astringency production to
optimize the postharvest treatments. This research contributes and
provides knowledge to address these goals.
Concerning breeding of new varieties, the IVIA persimmon
germplasm collection is an important resource for breeding of new
varieties. To ensure efficient breeding and avoid redundancy in the
collection, a SSR analysis was carried out to solve this problem. This
analysis has provided useful data, such as the discovery of unique
alleles, that allows rapid identification of varieties or the division of
the population according to its astringency type, confirming the
common genetic background of the accessions concerning to this
trait. The generated genetic diversity map will be useful for designing
crosses in the breeding program.
To address the salinity problem, several salt-stress assays were done
in greenhouse using different persimmon rootstocks populations:
Diospyros virginiana (salt-tolerant), Diospyros kaki (salt-sensitive fully
compatible) and Diospyros lotus (salt-sensitive). Furthermore, due to
the desirable characters present in these species, a backcross
progeny between D. kaki and D. virginiana was obtained and
included in the salt-stress assays. Thus, several individuals from all
the populations have been selected, which are tolerant to salinity
and could meet the desired characteristics for appropriate
persimmon clonal rootstocks. Furthermore we have used
physiological, transcriptomic and mass transcriptome sequencing
approaches in order to discover the physiological and genetic bases
of salinity tolerance in these species. As a result, we described the main facts related to salinity tolerance mechanisms in Diospyros
species, such as ion compartmentalization, HKT-1-like root
expression, abundancy of chloride channels and root architecture.
Finally, in order to get a deeper insight on the biosynthesis of
proanthocyanidins, the responsible molecule of astringency, we
hypothesized the presence of a MBW protein complex (MYB-bHLHWD40) in persimmon fruit, involved in the regulation of the
proanthocyanidins synthesis pathway in a similar way to other
species. We firstly sequenced the putative persimmon WD40
orthologue of TTG1 gene from Arabidopsis thaliana. The role of this
gene and other genes of the complex (MYB2, MYB4 and MYC1) was
studied through transcriptomic analysis in different stages of nonastringent and astringent fruit. Furthermore, we have observed
through microscopy the subcellular localization of these genes using
fluorescent protein fusions and transient expression in Nicotiana
benthamiana leaves, and analyzed its interaction through yeast twohybrid assays and BiFC (bimolecular fluorescence complementation)
experiments in Nicotiana benthamiana leaves. In addition, we have
analyzed the effects of these interactions in the pathway of
proanthocyanidin biosynthesis using the ANR (anthocyanidin
reductase) gene promoter and the promoters of some of these genes
(MYB4 and MYC1) fused with a luciferase reporter, together with the
coexpression of the MBW genes using transient expression in
Nicotiana benthamiana leaves. The results of these assays have
confirmed the nuclear interaction of these genes and its role in the
regulation of astringency biosynthesis, providing a basic model with some differences with respect to the models proposed in other
species. / [CA] El cultiu del caqui ha crescut enormement en la regió Valenciana en
els últims 20 anys al presentar-se com una alternativa interessant al
cultiu de cítrics. No obstant, el seu cultiu s’enfronta a tres problemes
importants. En primer lloc, la seua producció es monovarietal i està
centrada en la varietat Rojo Brillante, el que suposa un risc sanitari i
de mercat important que posa de manifest la necessitat de
augmentar el nombre de varietats disponibles. En segon lloc, el canvi
climàtic posa en perill la producció de caqui a la zona mediterrània
degut a un augment en la salinitat del aigua i del sòl. La salinitat
afecta de forma especialment al caqui degut al seus efectes sobre la
producció, qualitat i vida post collita de la fruita. La falta de patrons
tolerants a salinitat compatibles amb les condicions de cultiu a més
agreuja aquest problema, pel que es necessari el desenvolupament
de patrons clonals tolerants a salinitat. En tercer lloc, la industria del
caqui esta basada en la aplicació de tractaments post collita de
deastringència. Encara que existixen varietats naturalment no
astringents, el seu us al mediterrani es complicat degut a la
incompatibilitat en els patrons existents. A més, la salinitat afecta
gravement a la eficàcia del tractament post collita de deastringència.
Per això, cal destacar que es necessita conèixer millor els
mecanismes moleculars que controlen el desenvolupament de la
astringència per a la obtenció de noves varietats i/o uns tractaments
post collita més efectius.
En aquest context de millora genètica i biologia molecular, es poden
distingir tres objectius per a millorar les condicions del cultiu en
aquesta regió: el desenvolupament de noves varietats de caqui en
una època de maduresa distinta a la de Rojo Brillante, el
desenvolupament de patrons clonals tolerants a salinitat i
compatibles amb varietats no astringents i la obtenció de nous
coneixements sobre les bases moleculars del mecanisme de
producció de astringència per optimitzar els tractaments post collita.
La present tesi ha contribuït a aquests tres objectius.
En el que respecta a la obtenció de noves varietats, s’ha
desenvolupat un anàlisi de diversitat genètica del banc de
germoplasma de l’IVIA, el qual es un recurs important per a la
planificació de creuaments. Per a assegurar una millora genètica
eficient i evitar redundàncies a la col·lecció, s’ha efectuat un anàlisi
en microsatèl·lits. El anàlisi ha resultat en dades de gran utilitat, com
el descobriment de al·lels únics, que permiteixen la identificació
rapida de varietats, o la divisió de la col·lecció d’acord en el tipus
d’astringència del fruit, confirmant el fons genètic comú de les
accessions que comparteixen aquest caràcter. A més, el mapa de les
relacions filogenètiques elaborat serà de gran utilitat per a la
planificació futura de creuaments dins del programa de millora de
caqui.
Per a abordar el problema de la salinitat, s’han realitzat distints
assajos d’estrés salí en hivernacle amb distintes poblacions de patró
de caqui: Diospyros virginiana (tolerant a salinitat), Diospyros kaki
(sensible a salinitat i amb compatibilitat) i Diospyros lotus (sensible a salinitat). A més, degut als caràcters de gran interès presents en
aquestes dos espècies, es va incloure en els assajos una població
provenient de un retrocreuament entre D. kaki i D. virginiana. Com a
resultat, diversos individus d aquestes poblacions s’han seleccionat
degut a la seua tolerància a salinitat, ja que podrien tindre les
característiques adequades per a ser patrons clonals.
Complementàriament, s’han utilitzat aproximacions fisiològiques,
transcriptòmiques i de seqüenciació massiva de transcriptoma per a
fer una primera descripció dels mecanismes de tolerància a salinitat
presents en aquestes espècies. Com a resultat s’han descrit els
principals caràcters relacionats amb la tolerància a la salinitat en el
gènere Diospyros, com la compartimentalització de ions, la expressió
en arrel de un gen similar a HKT-1, la abundància de canals de clorur
o la arquitectura de la arrel.
Finalment, per a obtenir mes informació sobre la biosíntesi de
proantocianidines, la molècula responsable de la astringència, es va
formular la hipòtesi de la existència de un complex proteic del tipus
MBW (MYB-bHLH-WD40) que podria regular la ruta molecular de
forma anàloga a la regulació existent en altres espècies estudiades.
En primer lloc, es va seqüenciar el gen ortòlog putatiu del tipus WD40
de TTG1 de Arabidopsis thaliana. El paper de aquest gen i altres gens
del hipotètic complex (MYB2, MYB4 i MYC1) han sigut estudiats
mitjançant un anàlisi transcripcional en diferents estats de maduresa
de fruits astringents i no astringents. A més, s’ha observat amb
microscòpia la localització cel·lular de aquestos gens mitjançant la
expressió transitòria amb fusió a fluorescència en fulles de Nicotiana benthamiana i hem analitzat la seua interacció amb un assaig de
doble híbrid en llevat i BiFC (complementació bimolecular de
fluorescència) mitjançant expressió transitòria en fulles de Nicotiana
benthamiana. Finalment hem analitzat els efectes de aquests gens i
de les seues interaccions en la ruta de biosíntesi de proantocianidines
utilitzant el promotor del gen ANR (antocianidin reductasa) i
promotors dels gens reguladors MYC1 i MYB4 fusionant-los amb una
luciferasa com a gen delator i coexpressant-los amb diferents
combinacions dels gens del complex MBW mitjançant expressió
transitòria en fulles de Nicotiana benthamiana. Els resultats de
aquests assajos confirmen la interacció nuclear de aquestos gens i el
seu paper en la regulació de la producció de la astringència, donant
lloc a un model bàsic amb algunes diferències als proposats en altres
espècies. / Gil Muñoz, F. (2020). Biotechnological tools applied to the improvement of persimmon (Diospyros kaki Thunb) culture [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/153155 / Compendio
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upv.es/oai:riunet.upv.es:10251/153155 |
| Date | 26 October 2020 |
| Creators | Gil Muñoz, Francisco |
| Contributors | Badenes Catala, Marisa, Naval Merino, María del Mar, Prohens Tomás, Jaime, Universitat Politècnica de València. Departamento de Biotecnología - Departament de Biotecnologia |
| Publisher | Universitat Politècnica de València |
| Source Sets | Universitat Politècnica de València |
| Language | English |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/acceptedVersion |
| Coverage | east=-0.3762881; north=39.4699075; name=Valencia, Espanya |
| Rights | http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0048 seconds