Memoria para optar el título de Bioquímico / La shigelosis es una infección intestinal aguda causada por bacterias del género
Shigella, cuyos síntomas varían desde diarrea acuosa hasta disentería bacilar
inflamatoria grave. Shigella es un patógeno cuyo único hospedero es el humano,
presenta una muy baja dosis infectiva (solo 10 organismos viables pueden producir
enfermedad) y se contagia principalmente por vía fecal-oral. Esta bacteria permanece
dentro de las cuatro principales causas de diarrea moderada-grave en niños menores
de 5 años en países en vías de desarrollo, predominando el serogrupo S. flexneri, a
diferencia de nuestro país donde predomina el serogrupo S. sonnei. Con el transcurso
del tiempo, Shigella ha sido capaz de adquirir rápidamente diversos mecanismos de
resistencia a los antibióticos utilizados en su tratamiento, lo que genera la necesidad de
conocer el patrón de susceptibilidad que presenta este patógeno antes de comenzar la
terapia. Uno de los antibióticos utilizados en su tratamiento es el trimetoprim (Tmp), el
cual inhibe la actividad de la enzima dihidrofolato reductasa (DHFR). La resistencia a
este antibiótico se genera principalmente por la adquisición de genes dfr que codifican
para una enzima DHFR resistente a Tmp. En nuestro país, la resistencia a Tmp en
cepas de S. sonnei aisladas entre los años 1995 y 1997 se atribuye principalmente a la
presencia de los genes dfrA1 y dfrA8, pero en un brote de S. sonnei surgido en los
años 2008 y 2009, esta resistencia se debe a otro mecanismo no identificado. Además,
la mayoría de las cepas de S. sonnei aisladas después del brote, presentan resistencia
a Tmp pero su mecanismo de resistencia no ha sido estudiado.
Debido a esto, en el presente trabajo se propuso determinar el mecanismo de
resistencia a trimetoprim y evaluar su distribución en cepas de S. sonnei aisladas en nuestro país entre los años 1995 y 2013. Este mecanismo de resistencia se identificó
mediante el uso de una genoteca construida con el ADN de una cepa de S. sonnei
resistente a Tmp, revelando mediante secuenciación, un cassette genético que incluye
al gen dfrA14 como responsable de la resistencia a este antibiótico. Posteriormente, se
determinó la distribución del gen dfrA14 y de los genes previamente descritos dfrA1 y
dfrA8 mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en las cepas aisladas entre
los años 1995 y 2013. De esta forma, se obtuvo que entre los años 1995-1997 y 2004-
2006 predominó dfrA8, en tanto que el 100% de las cepas aisladas durante el brote
2008-2009 presentaron dfrA14. Posteriormente, en los años 2010-2011 se detectó la
presencia de dfrA1 y dfrA14 en proporciones similares y luego en el 2012-2013
reapareció además dfrA8. Adicionalmente, se determinó que la totalidad de las cepas
que presentan dfrA14, lo hacen en el contexto genético de un plásmido de 6779 pb,
capaz de otorgar resistencia a cotrimoxazol (mezcla de Tmp y sulfonamidas),
denominado pABC-3. Este plásmido es prácticamente idéntico a un plásmido de E. coli
denominado pCERC1, salvo por la ausencia de una repetición de 11 pb en su
secuencia. También es similar a otros plásmidos presentes en Shigella, cuya principal
diferencia es la ausencia de dfrA14. Esto sugiere dos posibles orígenes del pABC-3:
uno es la adquisición del plásmido desde una E. coli y el otro es la inserción del
cassette que contiene dfrA14 en los plásmidos presentes en Shigella.
En conclusión, en el presente trabajo se describe que la resistencia a Tmp en
cepas de S. sonnei aisladas en nuestro país se debe mayoritariamente a la presencia
de los genes dfrA1, dfrA8 y dfrA14 y que este último se encuentra en el contexto
genético del plásmido pABC-3, confiriendo resistencia a Tmp a la mayoría de las cepas
de S. sonnei aisladas en nuestro país desde el año 2004 hasta 2013 / Shigellosis is an acute intestinal infection caused by bacterial genus Shigella. Its
symptoms vary from watery diarrhea to severe inflammatory bacillary dysentery.
Shigella, a strictly human-pathogen, has a very low infectious dose (10 bacterial cells
can produce illness) and is transmitted via faecal-oral. This pathogen affects mainly
children under 5 years in developing countries, where S. flexneri is the most important
serogroup, while in Chile S. sonnei is the prevalent serogroup. The use of antibiotics
against Shigella is the first line therapy, however lately the acquisition of resistance
mechanisms has increased. Therefore, antimicrobial susceptibility profiles are required
before starting any treatment. Trimethoprim (Tmp), one of selected antibiotics against
this pathogen, inhibits the activity of the dihydrofolate reductase enzyme (DHFR). Tmpresistant
(TmpR) bacteria are mainly due to acquisition of dfr genes, coding for DHFR
enzymes. S. sonnei strains isolated in Chile between 1995 and 1997 showed the
presence of dfrA1 and dfrA8 genes, but the mechanism of Tmp-resistance in a later
outbreak (2008-2009) is unknown. The majority of S. sonnei strains isolated after the
outbreak are TmpR, but their resistance mechanism has not been studied yet.
The general aim of this study was to identify the genetic marker responsible of the
Tmp resistance mechanism in S. sonnei strains isolated between 1995 and 2013. A
DNA library was obtained from a representative TmpR S. sonnei strain from the
outbreak and a recombinant E. coli TmpR was isolated. Further, the sequenced clone
was identified as harbouring the dfrA14 gene. We evaluated the distribution of the dfrA14 gene and the previously described genes, dfrA1 and dfrA8 in a laboratory
collection of S. sonnei from 1995 – 2013. The results show that within periods 1995-
1997 and 2004-2006 the dfrA8 gene was the most prevalent, while 100% of the isolated
strains during the 2008-2009 outbreak present the dfrA14 gene. Later, between 2010
and 2011 dfrA1 and dfrA14 were detected in similar proportions, and then, between
2012 and 2013 dfrA8 reappeared. In addition, it was determined that the dfrA14 gene is
harboured in a 6779 bp plasmid, named pABC-3, which confers cotrimoxazole
resistance. This plasmid is nearly identical to the pCERC1 plasmid isolated from E. coli,
except for an 11 bp sequence missing in pABC-3, and similar to other Shigella
plasmids, without the insertion of the dfrA14 gene cassette. This suggests two possible
origins for the pABC-3 plasmid. One of them is the acquisition of the whole plasmid
from E. coli and the other is the insertion of the dfrA14 gene cassette into a Shigella
dfrA14 -less plasmid.
In conclusion, the present study showed that Tmp resistance in S. sonnei strains
isolated in Chile is mainly due to the presence of the dfrA1, dfrA8 and dfrA14 genes.
This last gene is found inside the pABC-3 plasmid conferring Tmp resistance to the
majority of S. sonnei strains isolated between years 2004 and 2013 in our country / Fondecyt
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/137819 |
| Date | January 2015 |
| Creators | Miranda Athens, Alfonso Nicolás |
| Contributors | Seelenfreund Hirsch, Daniela Joyce, Toro Ugalde, Cecilia Shirley, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
| Rights | Atribución-NoComercial-SinDerivadas 3.0 Chile, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/ |
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