La protéine SRSF1, aussi appelée ASF/SF2, fait partie de la famille des protéines SR, une famille de protéines liant l’ARN très conservées. Ces protéines jouent un rôle régulateur de l’épissage, également lors de l’épissage alternatif. Une centaine d’ARN cible ont été décrits pour SRSF1 mais la manière dont SRSF1 sélectionne ses cibles parmi tous les pré-ARNm est mal comprise. Des études in vitro et in vivo ont montré que les protéines SR reconnaissent un petit motif dégénéré qui est souvent présent en plusieurs copies dans les ESE («enhancer splicing element »). Bien que les protéines SR lient ces motifs avec une faible spécificité, la définition des exons se fait avec une grande fidélité. Afin de mieux comprendre le mécanisme d’action de SRSF1, j’ai réalisé une étude cinétique des interactions SRSF1-ARN dans les cellules vivantes par des techniques de microscopies avancées. Grâce au système CRISPR, j’ai pu étiqueter la protéine SRSF1 avec la protéine Halo puis j’ai combiné une technique de photo-blanchiment (FRAP) et une technique de suivi de particule unique (« single particle tracking, SPT) pour mesurer la diffusion de SRSF1 et son affinité pour l’ARN. J’ai mesuré la durée de vie des événements de liaison individuellement aussi bien sur le pool global de pré-ARNm que sur des cibles spécifiques. Nos résultats indiquent que la liaison de SRSF1 ne dépasse pas quelques secondes, même sur les cibles de haute affinité. Cette cinétique rapide permet à SRSF1 d’être en contact avec l’ensemble des transcrits naissants qui est produit en permanence dans la cellule. De plus, mon travail apporte une analyse cinétique de la dynamique des snRNP à la résolution de la molécule unique dans le nucléoplasme des cellules vivantes. Nous avons déterminé les coefficients de diffusion des snRNP et la durée de leur association à l’ARN dans ces cellules. / SRSF1, formerly known as ASF/SF2, belongs to the SR protein family, which is a conserved family of RNA-binding protein that plays essential roles as regulators of both constitutive and alternative splicing. Hundreds of RNA targets have been described for SRSF1 but how SRSF1 selects its targets from the entire pool of cellular pre-mRNAs remains an open question. In vitro and in vivo studies have shown that SR proteins recognize short degenerated motifs often present in multiple copies at ESEs. Similar cryptic motifs are however frequently present in pre-mRNAs, and this low specificity of binding contrasts with the great fidelity of exon definition. To better understand the mechanism of action of SRSF1, I performed a kinetic study of SRSF1-RNA interactions in live cells using advanced microscopic techniques. Taking advantage by the CRISPR system, I tagged endogenous SRSF1 with Halo protein, and I combined photobleaching (FRAP) and single particle tracking (SPT) techniques to estimate diffusion and binding rates of SRSF1. I measured the duration of individual binding events, both on the cellular pool of pre-mRNAs and on specific targets. Our results indicate that binding of SRSF1 does not exceed few seconds, even on high-affinity targets. This rapid kinetics allows SRSF1 to rapidly sample the entire pool of nascent RNAs continuously produced in cells. Moreover, we provided a kinetic analysis of snRNP dynamics at a single-molecule resolution in the nucleoplasm of living cells. Our results enabled us to determine diffusion coefficients of snRNPs and their RNA binding duration in vivo.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2016MONTT067 |
| Date | 11 July 2016 |
| Creators | Capozi, Serena |
| Contributors | Montpellier, Sourgens-Verheggen, Céline |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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