Most protein-encoding genes in Eukaryotes are separated into alternating coding and non-coding sequences (exons and introns). Following the transcription of the DNA into pre-messenger RNA (pre-mRNA) in the nucleus, a macromolecular complex termed spliceosome removes the introns and joins the exons to generate mature mRNA that is exported to the cytoplasm. There, it can be interpreted by ribosomes to generate proteins. The spliceosome consists of five small nuclear ribonucleic acids (snRNAs) and more than 150 proteins. Integral components of this complex are RNA-protein particles (RNPs) composed of one or two snRNAs, seven common (Sm) and a various number of snRNP-specific proteins. The Sm proteins form a ring-structure around a conserved site of the snRNA called Sm site. In vitro, Sm proteins (B/B', D1, D2, D3, E, F, G) and snRNA readily assemble to form snRNPs. In the context of the cell, however, two macromolecular trans-acting factors, the PRMT5 (protein arginine methyltransferases type 5) and the SMN (survival motor neuron) complex, are needed to enable this process. Initially, the Sm proteins in the form of heterooligomers D1/D2, D3/B and F/E/G are sequestered by the type II methyltransferase PRMT5. pICln, a component of the PRMT5 complex, readily interacts with Sm proteins to form two distinct complexes. Whereas the first one comprises pICln and D3/B the second one forms a ring consisting of pICln, D1/D2 and F/E/G (6S). It has been found that pICln prevents the premature interaction of snRNAs with the Sm proteins in these complexes and thus functions as an assembly chaperone imposing a kinetic trap upon the further assembly of snRNPs. PRMT5 catalyzes the symmetrical dimethylation of arginine residues in B/B', D1 and D3 increasing their affinity towards the SMN complex. Finally, the SMN complex interacts with the pICln-Sm protein complexes, expels pICln and mediates snRNP assembly in an ATP-dependent reaction. So far, only little is known about the action of PRMT5 in the early phase of snRNP assembly and especially how the 6S complex is formed. Studies of this have so far been hampered by the unavailability of soluble and biologically active PRMT5 enzyme. The composition of the SMN complex and possible functions of individual subunits have been elucidated or hypothesized in recent years. Still, the exact mechanism of the entire machinery forming snRNPs is poorly understood. In vivo, reduced production of functional SMN protein results in the neurodegenerative disease spinal muscular atrophy (SMA). How specific SMN mutations that have been found in SMA patients cause the disease remains elusive, yet, are likely to interfere with either SMN complex stability or snRNP assembly. The aim of this work was to establish an in vitro system to recapitulate the cytoplasmic assembly of snRNPs. This was enabled by the recombinant production of all PRMT5 and SMN complex components as well as Sm proteins in a combination of bacterial and insect cell expression systems. Co-expression of human PRMT5 and its direct interaction partner WD45 (WD-repeat domain 45) in Sf21 (Spodoptera frugiperda 21) insect cells resulted for the first time in soluble and biologically active enzyme. Recombinant PRMT5/WD45 formed complexes with Sm protein heterooligomers as well as pICln-Sm protein complexes but not with F/E/G alone. Also, the enzyme exhibited a type II methyltransferase activity catalyzing the mono- (MMA) and symmetrical dimethylation (sDMA) of Sm proteins B, D1 and D3. Two experimental setups were devised to quantitatively analyze the overall methylation of substrates as well as to identify the type and relative abundance of specific methylation types. Methylation of Sm proteins followed Michaelis-Menten kinetics. Complex reconstitutions and competition of the methylation reaction indicate that 6S is formed in a step-wise manner on the PRMT5 complex. The analysis of the methylation type could be applied to deduce a model of sequential MMA and sDMA formation. It was found that large Sm protein substrate concentrations favored monomethylation. Following a distributive mechanism this leads to the conclusion that PRMT5 most likely confers partial methylation of several different substrate proteins instead of processing a single substrate iteratively until it is completely dimethylated. Finally, the human SMN complex was reconstituted from recombinant sources and was shown to be active in snRNP formation. The introduction of a modified SMN protein carrying a mutation (E134K) present in spinal muscular atrophy (SMA) proved that mutated complexes can be generated in vitro and that these might be applied to elucidate the molecular etiology of this devastating disease. / Der Großteil der Protein-kodierenden Gene in Eukaryoten ist in kodierende und nicht-kodierende Regionen unterteilt - sogenannte Exons und Introns. Damit aus einem Gen ein Protein hergestellt werden kann, muss zunächst die genomische DNA im Rahmen der Translation in prä-messenger RNA (prä-mRNA; Boten-RNA) übersetzt werden. Aus dieser prä-mRNA werden anschließend durch einen makromolekularen Komplex (Spleißosom) die Introns entfernt und die kodieren Exons zusammengefügt. Die daraus resultierende gereifte mRNA dient letztendlich den Ribosomen als Vorlage zur Herstellung von Proteinen. Das Spleißosom besteht aus fünf snRNAs (small nuclear ribonucleic acids) und über 150 weiteren Proteinen. Zentrale Komponenten dieses Komplexes sind RNA-Protein Partikel (RNPs), die aus einer bzw. zwei snRNAs, sieben gemeinsamen (Sm) und weiteren snRNP-spezifischen Proteinen bestehen. Die Sm Proteine (B/B', D1, D2, D3, E, F and G) bilden eine Ringstruktur um eine konservierte Sequenz (Sm-site) der snRNA aus. In vitro erfolgt die Ausbildung dieser Struktur spontan. Im zellulären Kontext wird die Zusammenlagerung dieser snRNPs allerdings erst durch zwei makromolekulare, trans-agierende Proteinkomplexe, den PRMT5 und den SMN Komplex, ermöglicht. Zu Beginn interagieren die Sm Proteine als heterooligomere Strukturen bestehend aus D1/D2, D3/B und F/E/G mit der Typ II Methyltransferase PRMT5. pICln, eine Komponente des PRMT5 Komplexes, interagiert mit den Sm Proteinen und bildet zwei spezifische Komplexe aus. Während der erste aus pICln und D3/B besteht, lagern sich im zweiten die Sm proteine D1/D2 und F/E/G mit pICln zu einem Ring zusammen (6S Komplex). Diese Interaktion erzeugt eine kinetische Falle, so dass die Sm Proteine sich nicht mehr spontan an die snRNA anlagern können und somit die snRNP Biogenese verzögert wird. PRMT5 katalysiert die symmetrische Dimethylierung von Argininresten in B/B', D1 und D3, wodurch deren Affinität zum SMN Komplex erhöht wird. Letztendlich assoziert der SMN Komplex mit den zuvor erzeugten pICln-Sm Protein Komplexen, entlässt pICln und ermöglicht im weiteren die Zusammenlagerung von snRNPs in einer ATP-abhängigen Reaktion. Aktuell ist über die Funktion von PRMT5 in der frühen Phase der snRNP Biogenese wenig bekannt. Dies trifft insbesondere auf die Zusammenlagerung des 6S Komplexes zu. Biochemische Untersuchungen waren bis jetzt nahezu unmöglich, da rekombinant hergestelltes Protein entweder unlöslich oder biochemisch inaktiv war. In den vergangenen Jahren wurde viel über die Zusammensetzung des SMN Komplexes sowie über die Funktionen einzelner Untereinheiten herausgefunden aber auch spekuliert. Trotz alledem ist der genaue Mechanismus der snRNP Biogenese noch nahezu unbekannt. In vivo sind verringerte Mengen an funktionalem SMN Protein der Ausschlaggeber für die neurodegenerative Krankheit Spinale Muskelatrophie (SMA). Welchen Effekt Mutationen im SMN Protein haben, die in SMA Patienten festgestellt wurden ist ungewiss. Es ist allerdings zu vermuten, dass diese entweder die Integrität des SMN Komplexes negativ beeinflussen oder störend auf die snRNP Biogenese wirken. Das Ziel dieser Arbeit war es ein in vitro-System zu generieren, um die zytoplasmatische snRNP Biogenese biochemisch zu untersuchen. Dies geschah durch die rekombinante Produktion aller PRMT5 und SMN Komplex Komponenten sowie der Sm Proteine in einer Kombination von bakterieller und Insektenzell-Expression. Durch die Ko-Expression von humanem PRMT5 und dem Interaktionspartner WD45 (WD-repeat domain 45) in Sf21 (Spodoptera frugiperda 21) Insekten Zellen konnte erstmals lösliches und enzymatisch aktives Protein hergestellt werden. Rekombinantes PRMT5/WD45 bildete Komplexe mit heterooligomeren Sm Proteinen sowie pICln-Sm Protein Komplexen, allerdings nicht mit F/E/G. Zusätzlich konnte eine Typ II Methyltransferase Aktivität dadurch nachgewiesen werden, dass die Sm Protein B, D1 und D3 monomethyliert (MMA) und symmetrisch dimethyliert (sDMA) werden können. Zur weiteren Untersuchung wurden zwei experimentelle Ansätze erarbeitet, um die allgemeine Methylierungsaktivität sowie das relative Vorhandensein von Mono- und Dimethylargininen zu bestimmen. Es konnte gezeigt werden, dass die Methylierung der Sm Proteine einer Michael-Menten Kinetik folgt. Die Rekonstitution von PRMT-Sm Protein Komplexen sowie the Methylierungsreaktionen deuten auf eine schrittweise Zusammenlagerung von 6S auf dem PRMT5 Komplex hin. ...
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:5906 |
| Date | January 2012 |
| Creators | Neuenkirchen, Nils |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/doku/lic_ohne_pod.php, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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