A oxidação de proteínas é um fenômeno metabólico e a degradação de proteínas oxidativamente modificadas confere uma proteção para a célula, evitando acúmulo e a agregação das mesmas. A ineficiência na remoção destas proteínas está relacionada ao processo de envelhecimento e ao aparecimento de doenças neurodegenerativas. A unidade catalítica do proteassomo, denominada de 20S (PT20S), é a principal via de degradação de proteínas danificadas pela oxidação sem que haja gasto de ATP, acoplamento de subunidades regulatórias ou poli-ubiquitinação do substrato proteico. A unidade PT20 por sua vez, pode sofrer modificação pós-traducional chamada de S-glutationilação, que aumenta a velocidade degradação proteica por processo independente de poli-ubiquitinação. Em levedura (Saccharomyces cerevisiae), foram identificados apenas dois resíduos de Cys glutationilados, ambos na subunidade α5 (α5-76 e α5-221). A S-glutationilação ocasiona a abertura da câmara catalítica e uma maior eficiência na degradação de proteínas. Mutações sítio-específicas foram realizadas nessas Cys pela substituição por Ser. As consequências estruturais e funcionais dessas mutações foram o aumento da frequência da conformação fechada da câmara catalítica no α5-76S-PT20S e α5-221S-PT20S. As linhagens que carregam essas mutações apresentaram menor tempo de vida cronológico. Uma dupla mutação randômica na subunidade α5 (S35P / C221S) induziu a abertura da câmera catalítica do 20SPT e esta linhagem apresentou tempo de vida cronológico significativamente aumentado e , aumento na resistência ao estresse oxidativo em paralelo ao aumento da atividade catalítica do 20SPT. O objetivo neste projeto de pesquisa foi realizar uma análise proteômica quantitativa no extrato celular das linhagens mutantes, com o objetivo de identificar proteínas que possam estar relacionadas com a regulação da longevidade celular. Foram selecionadas as linhagens que carregam as mutações: α5-76S e α5-S35P/C221S uma vez que apresentaram expectativa de vida oposta em relação à linhagem selvagem, além de queda e aumento da frequência da conformação aberta da câmera catalítica, respectivamente. A partir da quantificação sem marcação (Label-free quantification), foram identificadas 723-1000 proteínas nas amostras das linhagens selvagem e mutantes. Dentre elas, destacam-se as proteínas 3-isopropilmalato isomerase e argininossuccinato sintase, envolvidas na síntese de leucina e arginina, respectivamente, aumentadas na linhagem mutante C76S e reduzidas na linhagem S35P/C221S. O metabolismo de ambos os aminoácidos está relacionado com a via de sinalização TOR que, por sua vez, está envolvida com o tempo de vida cronológico em levedura. / The protein oxidation is a metabolic phenomenon and the degradation of oxidatively modified proteins confers a protection to cell, avoiding accumulation and aggregation of these proteins. The inefficiency in the removal of these proteins is related to aging process and neurodegenerative diseases. The catalytic unit of the proteasome, named 20S (PT20S) is the main degradative pathway of oxidized proteins in an ATP-independent manner, without proteasomal regulatory units assembly or protein poliubiquitination. The PT20 unit undergoes a post-translational modification named S-glutationilation, which increases the protein degradation by the ATP-independent process. In yeast, only two Cys residues were identified glutationilated, both in the α5 subunit (α5-C76 e α5-C221). The S-glutationilation causes opening of the catalytic chamber and higher efficiency of protein hydrolysis. Site-specific mutations were performed in those Cys residues by their replacement to Ser. The structural and functional consequences of mutations were the increasedfrequency of theclosed conformation of the catalytic chamber in the α5-76S-PT20S and α5-221S-PT20S. The strains carrying those mutations presented shorter chronological life span. A double random mutation in the α5 subunit (S35P / C221S) induced the opening of 20SPT catalytic chamber together toextended chronological life span and, increased resistant to oxidative stress in parallel to increased catalytic activity of the 20SPT. The goal of this project was to perform a label-free quantitative proteomic analysis in the mutant strains to identify proteins that could be related with the regulation of cellularlifespan. From that quantification, 723 - 1000 proteins were identified in the samples of the wild-type and mutant strains. Among these proteins, 3-isopropylmalate isomerase and argininesuccinate sintase, involved in the leucine and arginine biosynthesis, respectively, were found increased in the C76S mutant strain and reduced in the S35P/C221S mutant strain. The metabolism of both amino acids is related with TOR signallingthat, in turn,modulates chronological lifespan in yeast
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-04122018-134102 |
| Date | 17 September 2018 |
| Creators | Santiago, Verônica Feijoli |
| Contributors | Demasi, Marilene |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Reter o conteúdo por motivos de patente, publicação e/ou direitos autoriais. |
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