La biologie des réactions redox est particulièrement difficile à étudier de par la compartimentation spatiale mais aussi cinétique des différents systèmes redox cellulaires. Les biosenseurs codés génétiquement, incluant la «redox-sensitive Yellow Fluorescent Protein» (rxYFP) sont une manière de contourner les limitations des méthodes conventionnelles de mesure du couple glutathion/glutathion disulfure (GSH/GSSG). Cette étude présente l’utilisation des biosenseurs rxYFP pour analyser les états redox dans des différents compartiments cellulaires, et leur dynamique en réponse au stress dans les cellules humaines. La rxYFP exprimée soit dans le cytosol, le noyau ou la matrice mitochondriale de cellules HeLa s’est révélée sensible aux changements de l’état redox intracellulaire provoqué par des traitements aussi bien réducteurs qu’oxydants. La rxYFP est capable de détecter des différences de l’état redox, entre les compartiments, mais aussi entre différentes lignées cellulaires. Les senseurs exprimés dans des kératinocytes humain de l’épiderme HEK001 ont réagi au stress induit par les UVA, de façon dose-dépendante, mais pas au stress induit par les UVB. De plus, ces senseurs ont pu détecter les changements redox induits par des faibles doses (30 µM) ainsi que par des doses modérées (100 µM) de peroxyde d’hydrogène (H2O2), de façon dynamique et spécifique des compartiments cellulaires. La rxYFP exprimé dans la matrice mitochondriale a montré une vitesse d’oxydation plus élevée que les senseurs rxYFP exprimés dans le cytosol ou le noyau, ce qui est attribuable à un pH local plus basique. De plus, la déplétion en GSH provoquée par un traitement au buthionine sulphoximine (BSO) a affecté spécifiquement le potentiel redox mitochondrial mais pas cytosolique ni nucléaire. Ces observations soutiennent l’idée que l’état redox du GSH mitochondrial est maintenu et régulé de façon indépendante par rapport à celui du cytosol ou du noyau. Nous avons également montré que dans les cellules humaines, les sondes rxYFP réagissent de façon prédominante avec le GSH/GSSG, puisque la déplétion en GSH ralentit la vitesse d’oxydation de la rxYFP en réponse à un traitement par H2O2. De plus, grâce à l’utilisation des sondes rxYFP et à l’analyse de l’état redox des antioxydants cellulaires, nous démontrons que l’oxydation des thiols se produit après l’activation des caspases au cours de l’apoptose induite par TRAIL. L’ensemble de nos données montrent la robustesse des senseurs rxYFP pour la mesure des changements d’état redox dans les cellules humaines. En complément d’autres senseurs redox ainsi que des méthodes conventionnelles de mesure des états redox, les senseurs rxYFP ciblés aux différents compartiments cellulaires sont un nouvel outil pour étudier l’homéostasie redox dans les cellules de mammifères, et permettent l’étude de l’état redox du glutathion et de la dynamique des changements redox avec une grande précision. / The kinetic and spatial separation of redox systems renders redox biology studies a particularly challenging field. Genetically encoded biosensors including the glutathione-specific redox-sensitive yellow fluorescent protein (rxYFP) may provide an alternative way to overcome the limitations of conventional glutathione/glutathione disulfide (GSH/GSSG) redox measurements. This study describes the use of rxYFP sensors for investigating compartment-specific steady redox states and their dynamics in response to stress in human cells. RxYFP expressed either in the cytosol, nucleus or mitochondrial matrix of HeLa cells was responsive to the intracellular redox state changes induced by reducing as well as oxidizing agents. Compartment-targeted rxYFP sensors were able to detect different steady state redox conditions between the cytosol, nucleus and mitochondrial matrix as well as between the cell lines. These sensors expressed in human epidermal keratinocytes HEK001 responded to stress induced by UVA radiation in a dose-dependent manner but not to UVB radiation. Furthermore, rxYFP sensors were able to sense dynamic and compartment-specific redox changes caused by low dose (30 µM) and moderate dose (100 M) hydrogen peroxide (H2O2). Mitochondrial matrix-targeted rxYFP displayed a greater dynamics of oxidation in response to a H2O2 challenge than the cytosol- and nucleus-targeted sensors, largely due to a more alkaline local pH environment. Similarly, the depletion of glutathione induced by buthionine sulphoximine (BSO) affected selectively mitochondrial redox potential without inducing changes in cytosol and nucleus. Furthermore, using rxYFP probes and cellular antioxidants redox state analysis, we show that oxidation of thiols occurs after activation of caspases during TRAIL-induced apoptosis. These observations support the view that mitochondrial glutathione redox state is maintained and regulated independently from that of the cytosol and nucleus. We also showed that in human cells the rxYFP probes react predominantly with glutathione since the glutathione depletion slows down the dynamics of rxYFP oxidation in response to H2O2. Taken together, our data show the robustness of the rxYFP sensors to measure compartmental redox changes in human cells. Complementary to existing redox sensors and conventional redox measurements, compartment-targeted rxYFP sensors provide a novel tool for examining mammalian cell redox homeostasis, permitting high resolution readout of steady glutathione state and dynamics of redox changes.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2013PA112346 |
| Date | 18 December 2013 |
| Creators | Banach-Latapy, Agata |
| Contributors | Paris 11, Huang, Meng-Er |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text, Image |
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