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Previous issue date: 2016-06-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Technological development and market pressure turned polymers into widely used
structural materials for several different applications, being manufactured by a wide
range of monomers. However, traditional polymers usually show some drawbacks
regarding environmental aspects, as most used polymers are produced with nonrenewable
feedstock and generate huge amounts of non-biodegradable residues.
Therefore it is imperative the sustainable development of new bio-based and
biodegradable polymeric materials. The use of microorganisms for obtaining
biopolymers is a very promising reality. However, in order to achieve viable
production in industrial scale it is necessary to overcome economic barriers, by using
microbes with good assimilation of low-cost substrates and high biopolymer yields.
As such, the objective of this work was the isolation and identification of bacteria
associated with the insect Diabrotica speciosa, as well as the evaluation microbial
capacity of biopolymer production. The insect presented great microbial diversity,
identified as an underexplored niche with tremendous biotechnological potential for
the investigation of novel species and/or strains. In an attempt to find bacterial
isolates effective on the production of two classes of biopolymers,
polyhydroxyalkanoates (PHA) and exopolysaccharides (EPS), it was obtained 73
strains of bacteria associated with Diabrotica speciosa. These bacteria were
identified at genus level by genetic techniques using 16S rDNA sequencing and by
proteomic techniques using MALDI-TOF MS. Both characterization methods yielded
100% convergence on results. It was found 17 different bacterial genera, which were
submitted to qualitative screening assays in order to identify strains producing PHA
using Nile Red dye method, as well as for EPS by using the bacterial spot test.
Promising strains on both assays were selected for further quantitative studies and
structural characterization of the obtained biopolymers. Quantitative analyses for
PHA production corroborated satisfactorily with qualitative results, especially to
bacteria from genera Aurantimonas and Delftia which demonstrated high PHA
production capacity with 50 and 90% polymer yield on dry mass, both strains being
strains able to use substrates such as glucose, acetate and glycerol. GC-MS
analyses indicated that Aurantimonas sp. produced mostly a homopolymer of
polyhydroxybutyrate (PHB), while Delftia sp. was able to produce a copolymer having butyrate and valerate (PHBV), with up to 10% (w/w) of valerate. Regarding EPS
production, the screening showed that the isolates were able to produce polymers in
variable amounts, with vast and complex structural variations. Strains from genera
Acidovorax, Aurantimonas and Luteibacter were further selected for quantitative
analysis of EPS production and analytical characterization of the obtained
biopolymer. After analyses using NMR, MALDI-TOF, SEC-UV-ELSD and GC-MS,
bacteria from genus Luteibacter produced a highly complex polymer rich in mannose,
glucose, fucose and xylose; genus Acidovorax produced a glucomannan-type EPS
with a high degree of branching; and genus Aurantimonas was able to produce up to
2 g.L-1 of a water insoluble EPS. In face of these results, it was possible to conclude
that D. speciosa microbiota showed to be extremely rich in bacterial species viable
for exploratory studies with biotechnological context of biopolymer production.
Investigated strains showed promising characteristics to be further evaluated in
larger scale (fermenters), especially the bacteria Aurantimonas sp., able to produce
PHBV and EPS. / O desenvolvimento tecnológico e a pressão de mercado fizeram com que os
polímeros se tornassem materiais estruturais amplamente utilizados em uma grande
variedade de aplicações, sendo manufaturados a partir de uma ampla gama de
monômeros. Entretanto, estes materiais geralmente apresentam algumas
desvantagens do ponto de vista ambiental, pois os polímeros mais utilizados são
produzidos com matérias-primas não renováveis e geram grandes volumes de
resíduos não biodegradáveis. Assim, torna-se necessário o desenvolvimento
sustentável de novos materiais biobaseados e biodegradáveis. O uso de microorganismos
para a obtenção deste tipo de polímero é uma realidade bastante
promissora. Todavia, para a produção viável em escala industrial é necessário
superar barreiras econômicas, através do uso de cepas com boa assimilação de
substratos de baixo custo, proporcionando uma alta produtividade. Assim, este
trabalho teve por objetivo o isolamento e identificação de bactérias associadas ao
inseto Diabrotica speciosa, bem como a avaliação da capacidade microbiana de
produção de biopolímeros. O inseto apresentou uma grande diversidade em sua
microbiota, mostrando ser este um nicho subexplorado e com enorme potencial para
a investigação de novas espécies e/ou isolados. Com o propósito de encontrar
isolados eficientes na produção de duas classes de biopolímeros,
polihidroxialcanoatos (PHAs) e exopolissacarídeos (EPS), foram obtidos 73 isolados
bacterianos do inseto praga Diabrotica speciosa. Todas as cepas foram identificadas
em nível de gênero pelo uso de técnicas genéticas, através do sequenciamento de
16S rDNA parcial e por análises proteômicas, avaliando-se o perfil proteico obtido
via MALDI-TOF MS. Ambas as técnicas de identificação apresentaram 100% de
convergência entre os resultados. Foram encontrados no total 17 gêneros de
bactérias, que foram submetidas a ensaios qualitativos de triagem para identificação
de isolados produtores de PHAs pelo método do corante vermelho de Nilo, bem
como para EPS pelo método do teste de ponto bacteriano. Isolados promissores em
ambos os ensaios foram selecionados para estudos quantitativos e caracterização
estrutural dos polímeros obtidos. As análises quantitativas para a produção de PHA
corroboraram satisfatoriamente com os resultados qualitativos, com destaque para
as bactérias do gênero Aurantimonas e Delftia que apresentaram alta capacidade de produção de PHA, com rendimentos de 50 e 90% de polímero em massa seca,
respectivamente, sendo ambas as cepas capazes de utilizar substratos como
glicose, acetato e glicerol. Análises por GC-MS realizadas após metanólise do
polímero indicaram que Aurantimonas sp. produziu majoritariamente homopolímero
de polihidroxibutirato (PHB), enquanto Delftia sp. foi capaz de produzir um
copolímero contendo monômeros do tipo butirato e valerato (PHBV), contendo até
10% em massa de valerato. Com relação à produção de EPS, a triagem indicou que
os isolados se mostraram capazes de produzir polímeros em quantidade variáveis,
com uma grande e complexa variação estrutural. Isolados dos gêneros Acidovorax,
Aurantimonas e Luteibacter foram selecionados para avaliação quantitativa da
produção de EPS e caracterização estrutural do biopolímero. Após análises por
NMR, MALDI-TOF, SEC-UV-ELSD e GC-MS, o gênero Luteibacter produziu um
polímero altamente complexo contendo manose, glicose, fucose e xilose, o gênero
Acidovorax produziu um EPS do tipo glucomanana altamente ramificado;= e o
gênero Aurantimonas foi capaz de produzir até 2 g.L-1 de um EPS insolúvel em
água. Deste modo, foi possível concluir que a microbiota de D. speciosa se
apresentou extremamente rica em isolados microbianos viáveis para estudos
exploratórios no contexto biotecnológico de produção de biopolímeros. Os isolados
investigados apresentaram características promissoras para serem futuramente
avaliadas em escalas maiores (fermentadores), especialmente a bactéria
Aurantimonas sp., que foi capaz de produzir tanto PHBV, quanto EPS.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufscar.br:ufscar/8560 |
| Date | 24 June 2016 |
| Creators | Perlatti, Bruno |
| Contributors | Forim, Moacir Rossi |
| Publisher | Universidade Federal de São Carlos, Câmpus São Carlos, Programa de Pós-graduação em Química, UFSCar |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSCAR, instname:Universidade Federal de São Carlos, instacron:UFSCAR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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