Des protéines à base de l'hème sont impliquées dans une large gamme de fonctions biologiques, y compris la respiration, le transport de l'oxygène et la détoxification des xénobiotiques. Surtout, les protéines senseurs bactériens à base de l'hème exploitent les propriétés de liaison de l'hème pour détecter les gaz environnementaux. Cette thèse focalise sur l'étude de la dynamique interne des hémo-protéines senseurs à gaz 6-coordonnées CooA, de Rhodospirillum rubrum et DNR de Pseudomonas aeruginosa, qui sont impliquées dans l'adaptation du métabolisme de l'organisme à son environnement. CooA et DNR, appartenant à la famille importante de protéines catabolites activatrices des gènes, sont des facteurs de transcription qui se lient à l'ADN lors de l'activation par des molécules diatomiques gazeuses, permettant ainsi à la transcription de gènes spécifiques. Les deux protéines senseur potentiellement subissent un important changement conformationnel délocalisé lors de la liaison du ligand physiologique à l'hème (CO pour CooA et NO pour DNR). Ici des techniques avancées de spectroscopie optique sont utilisées pour étudier le mécanisme et la voie moléculaire de l'activation / désactivation dans cette classe de protéines. Des interactions protéine-ADN ont été étudiées avec des techniques de fluorescence à l'équilibre et ultrarapide femtoseconde, en utilisant des substrats d'ADN marqués. Une liaison de l'ADN, sensible au ligand physiologique, dans la gamme d'affinité nanomolaire a été déduite des expériences d'anisotropie. Du " quenching " de la fluorescence du marqueur fluorescent par transfert d'énergie à l'hème natif a été observée et la vitesse de ce processus, qui reflète la distance hème-substrat, a été déterminé directement des cinétiques mesurées de la fluorescence. Cette observation ouvre la perspective d'une cartographie des changements conformationnels globaux de la protéine à l'aide des techniques FRET résolu en temps. Les processus primaires dans les mécanismes de bascule des hémo-senseurs concernent la liaison et la dissociation du ligand de l'hème. Des expériences d'absorption femtosecondes transitoires ont été réalisées afin d'étudier la dynamique de ligands dans CooA et DNR proche de l'hème. Dans DNR, après photodissociation de NO, une recombinaison géminée particulièrement rapide et efficace a été observée. Cela renforce fortement l'hypothèse que des senseurs à NO agissent comme des pièges à ligands. En outre, les barrières énergétiques liées à la migration de CO ont été déterminées dans les deux protéines senseurs par des études de la dépendance de la température. Toutes les protéines senseurs 6- coordonnées, qui fonctionnent par l'échange d'un résidu interne et de la molécule de gaz en tant que ligand de l'hème, démontrent une recombinaison sans barrières et une évasion thermiquement activée du CO de la poche de l'hème. En revanche, la barrière pour l'évasion du CO apparaît plus faible ou même absente pour les systèmes 5-coordonnées, comme cela a été trouvé pour le senseur à hème mycobactérien DosT. Ces résultats mettent en évidence un mécanisme général, où des mouvements intra-protéiques similaires sont nécessaires pour les deux, l'échange de ligand et l'évasion de ligand. Pour des raisons de comparaison, les barrières énergétiques ont également été étudiées dans des variantes de la protéine de transfert d'électrons cytochrome c. Ici, un mécanisme plus complexe de barrières multiples dans la voie d'échappement du ligand a été déduit. Cette propriété est proposée de provenir de la nature plutôt rigide de cette protéine non-senseur, qui contient un hème 6-coordonnée et est dépourvu de voies d'entrée de ligand à l'état natif. Enfin, les processus primaires dans les domaines de l'hème, de type sauvage et de mutants, du senseur à oxygène YddV, récemment découvert dans Escherichia coli, ont été étudiés. En particulier, un rôle important dans la dynamique de ligands a été élucidé pour le résidu tyrosine distale. Ce résidu, qui forme des liaisons hydrogène avec O2 et NO liés à l'hème, a un effet remarquablement discriminant: après dissociation respective de l'hème, il assiste fortement à la reliaison de l'O2, mais favorise l'évasion du NO de la poche de l'hème.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:CCSD/oai:pastel.archives-ouvertes.fr:pastel-00866894 |
| Date | 23 September 2013 |
| Creators | Lobato, Laura |
| Publisher | Ecole Polytechnique X |
| Source Sets | CCSD theses-EN-ligne, France |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | PhD thesis |
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