Submitted by Claudinei Pracidelli (cpracide@ipen.br) on 2015-11-12T10:39:15Z
No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2015-11-12T10:39:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / O sistema de expressão baseado nos promotores PL ou PR do fago lambda que usualmente é regulado pelo repressor termo lábil (cIts) é amplamente utilizado para produzir proteínas recombinantes em células procarióticas. No entanto, o aumento da temperatura requerido neste sistema para promover a inativação do repressor apresenta algumas limitações, como o aumento da expressão de proteínas de HSP (Heat Shock Proteins), por exemplo, proteases, que dependendo da natureza da proteína expressa podem ser prejudiciais ou não. Uma outra limitação é a ativação da resposta SOS, resultando na parada da replicação do DNA celular ou dependendo da cepa pode ocorrer lise celular. Nesse trabalho nós descrevemos o uso do promotor λPL para expressão constitutiva, isto é, sem a regulação do repressor. Nós otimizamos diferentes condições de cultura para aumentar a secreção no espaço periplásmico de Escherichia coli de cinco proteínas: o hormônio do crescimento humano (hGH), que tem sido amplamente utilizado no tratamento de crianças com deficiência e/ou resistência ao hGH, síndrome de Turner, entre outras desordens; prolactina humana (hPRL), um hormônio polipeptídico conhecido por estimular a lactação e por exercer ação regulatória no crescimento e na diferenciação da glândula mamária, dois antagonistas de hPRL, estudados como potenciais fármacos para o tratamento de alguns tipos de cânceres e por fim o interferon α2a (IFN-α2a), que é uma citocina produzida pelas células, em resposta a diferentes estímulos, incluindo ácidos nucléicos virais, células estranhas (particularmente as neoplásicas), antígenos de bactérias, protozoários e vírus. No caso do IFN-α2a, essa citocina de alto valor agregado e de importante aplicação terapêutica, foi desenvolvida em nosso laboratório como parte desse trabalho, incluindo o desenvolvimento e a validação da metodologia de análise por HPLC de fase reversa para determinação do IFN presente no fluído periplásmico bacteriano ou na sua forma pura. As principais estratégias utilizadas para melhorar a expressão foram iniciar a indução junto à densidade óptica máxima do crescimento bacteriano e otimizar a temperatura de indução para controlar a expressão da proteína heteróloga. Essa metodologia pode ser utilizada nos casos onde o produto não será tóxico para a célula hospedeira ou quando a instabilidade do plasmídeo não é problema. A possibilidade de cultivo em temperaturas mais baixas, já que o repressor termo-sensível não se encontra presente, colaborou para o aumento significativo da expressão, mesmo para proteínas menos sensíveis à temperatura de cultivo, como o hGH. / Tese (Doutorado em Tecnologia Nuclear) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ipen.br:123456789/25195 |
| Date | 12 November 2015 |
| Creators | PEREZ, FERNANDA dos S.A. |
| Contributors | Carlos Roberto Jorge Soares |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | 87 |
| Source | reponame:Repositório Institucional do IPEN, instname:Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares, instacron:IPEN |
| Coverage | N |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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