La tagatose-1,6-biphosphate aldolase de Streptococcus pyogenes est une aldolase de
classe I qui fait montre d'un remarquable manque de spécificité vis à vis de ses
substrats. En effet, elle catalyse le clivage réversible du tagatose-1,6-biphosphate (TBP), mais également du fructose-1,6-biphosphate (FBP), du sorbose-1,6-biphosphate et du psicose-1,6-biphosphate, quatre stéréoisomères, en dihydroxyacétone phosphate (DHAP) et en glycéraldéhyde-3-phosphate (G3P). Afin de mettre à jour les caractéristiques du mécanisme enzymatique, une étude structurale de la TBP aldolase de S. pyogenes, un pathogène humain extrêmement versatile, a été entreprise. Elle a permis la résolution de la structure native et en complexe avec le DHAP, a respectivement 1.87 et 1.92 Å de résolution. Ces mêmes structures ont permis de se représenter plus clairement le site actif de l'enzyme en général, et les résidus catalytiques en particulier.
Le trempage des cristaux de TBP aldolase dans une solution saturante de DHAP a en
outre permis de piéger un authentique intermédiaire iminium, ainsi que sa géométrie
particulière en atteste. Des expériences d'échange de proton, entreprises afin d'évaluer le stéréoisomérisme du transfert de proton catalytique, ont également permis de faire une intéressante découverte : la TBP aldolase ne peut déprotoner le coté pro-R du C3 du DHAP, mais peut le protonner. Ce résultat, ainsi que la comparaison de la structure du complexe TBP aldolase-DHAP avec la structure du complexe FBP aldolase de muscle de lapin- DHAP, pointe vers un isomérisme cis-trans autour du lien C2-C3 de la base de Schiff formée avec le DHAP.
De plus, la résolution de ces deux structures a permis de mettre en évidence trois régions très mobiles de la protéine, ce qui pourrait être relié au rôle postulé de son isozyme chez S. pyogenes dans la régulation de l’expression génétique et de la virulence de la bactérie.
La cristallographie par rayons X et la cinétique enzymatique ont ainsi permis d'avancer dans l'élucidation du mécanisme et des propriétés structurales de cette enzyme aux caractéristiques particulières. / Tagatose-1,6-biphosphate aldolase from Streptococcus pyogenes is a class I aldolase that shows a lack of stereospecificity that is rare in enzymes in general, and in aldolases in particular. This aldolase catalyzes the reversible cleavage of tagatose-1,6-biphosphate (TBP), fructose-1,6-biphosphate (FBP), sorbose-1,6-biphosphate and psicose-1,6-biphosphate, four stereoisomers, in dihydroxyacetone phosphate and glyceraldehyde-3-phosphate (DHAP). In order to understand its mechanism, a structural study of TBP aldolase from S. pyogenes, one of the most versatile and virulent human pathogen, was initiated and high resolution crystallographic structures of native and DHAP-liganded TBP aldolase were solved. These structures allowed us to gain informations regarding active site residues implicated in catalysis and that give rise to the apparent lack of specificity. Soaking of TBP aldolase crystals in saturating DHAP solution specifically trapped the iminium intermediate, as demonstrated by its geometry. Furthermore, proton transfer studies uncovered an interesting phenomenon: TBP aldolase from S. pyogenes is unable to detritiate pro-R labelled hydrogen position at C3 of DHAP, yet it is able to tritiate both the pro-R and the pro-S position. These results, taken together with the superposition of the DHAP-TBP aldolase with the DHAP-FBP aldolase from rabbit muscle, suggest a cis-trans isomerism about the Schiff base C2-C3 bond.
The resolution of both the native and the liganded structure also proved useful in identifying three very mobile regions in the protein. This trend could be linked to the putative metabolic sensor and genetic expression regulator role of LacD.1 in S. pyogenes.
X-rays crystallography and traditional enzymatic kinetics allowed us to gain insights into the catalytic mechanism and others structural properties of this important metabolic enzyme.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMU.1866/4111 |
| Date | 10 1900 |
| Creators | LowKam, Clotilde |
| Contributors | Sygusch, Jurgen |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Thèse ou Mémoire numérique / Electronic Thesis or Dissertation |
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