The aim of current work was contribution to the long-term ongoing project on developing human IL-5 agonists/antagonists that intervene with or inhibit IL-5 numerous functions in cell culture and/or in animal disease models. To facilitate design of an IL-5 antagonist variant or low-molecular weight mimetics only capable of binding to the specific receptor alpha chain, but would lack the ability to attract the receptor common β-chain and thus initiate receptor complex activation it is necessary to gain the information on minimal structural and functional epitopes. Such a strategy was successfully adopted in our group on example of Interleukin 4. To precisely localize minimal structural epitope it is essential to have structure of the ligand in its bound form and especially informative would be structure of complex of the ligand and its specific receptor alpha chain. For this purpose large quantities (tens of milligrams), retaining full biological activity IL-5 and extracellular domain of IL-5 specific receptor α-chain were expressed in a bacterial expression system (E.coli). After successful refolding proteins were purified to 95-99% Stable and soluble receptor:ligand complex was prepared. Each established purification and refolding procedures were subjected to optimization targeting maximal yields and purity. Produced receptor:ligand complex was applied to crystallization experiments. Microcrystals were initially obtained with a flexible sparse matrix screening methodology. Crystal quality was subsequently improved by fine-tuning of the crystallization conditions. At this stage crystals of about 800x150x30µm in size can be obtained. They possess desirable visible characteristics of crystals including optical clarity, smooth facecs and sharp edges. Crystals rotate plane polarized light reflecting their well internal organization. Unfortunately relative slimness and sometimes cluster nature of the produced crystals complicates acquisition of high-resolution dataset and resolution of the structure. With some of obtained crystals diffraction to a resolution up to 4Å was observed. / Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, einen Beitrag zum langfristigen Projekt der Entwicklung humaner IL-5 Agonisten/Antagonisten zu leisten, die im tierischen Krankheitsmodell oder in der Zellkultur in die verschiedenen Funktionen des IL-5 eingreifen oder sie inhibieren. Um das Design eines IL-5 Antagonisten oder einer Mimetika mit geringem Molekulargewicht zu vereinfachen, die nur an die spezifische α-Rezeptorkette bindet, nicht jedoch an die gemeinsame β-Kette und somit die Aktivierung des Rezeptorkomplexes initiieren, ist es notwendig, Informationen über minimale strukturelle und funktionelle Epitope zu erhalten. Diese Strategie wurde in unserer Arbeitsgruppe erfolgreich am Beispiel von Interleukin 4 angewandt. Um minimale strukturelle Epitope präzise zu lokalisieren, ist es es notwendig, die Struktur des Liganden in seiner gebundenen Form zu kennen. Besonders informativ wäre die Struktur des Komplexes aus Ligand und spezifischer Rezeptor α-Kette. Zu diesem Zweck wurden große Mengen (einige 10 mg) IL-5 mit vollständiger biologischer Funktionaltät und der extrazellulären Domäne der IL-5 spezifischen Rezeptor α-Kette in einem bakteriellen Expressionssystem (E. coli) exprimiert. Nach erfolgreicher Faltung wurden die Proteine zu einer Reinheit von 95-99% aufgereinigt und ein stabiler und löslicher Rezeptor:Ligandenkomplex erzeugt. Die erfolgreiche Aufreinigung und Faltungsprozedur wurde bezüglich maximaler Menge und Reinheit optimiert. Mit den produzierten Rezeptor:Ligandenkomplexen wurden Kristallisationsexperimente durchgeführt. Zunächst wurden mit einer flexiblen Sparse-Matrix Screening Methode Mikrokristalle erzeugt. Die Qualität der Kristalle wurde dann durch Feinabstimmung der Kristallisationsbedingungen verbessert. In diesem Stadium wurden Kristalle von etwa 800x150x30µm Größe erzeugt, die die gewünschten optischen Eigenschaften wie glatte Oberflächen und scharfe Kanten besaßen. Die Kristalle drehen die Polarisationsebene linear polarisierten Lichtes, was ihren gleichmäßigen Aufbau zeigt. Leider verkompliziert die geringe Dicke und das teilweise Auftreten von Clustern die Aufnahme hochauflösender Daten und damit Auflösung der Struktur. Mit einigen der erhaltenen Kristalle wurde eine Beugung bis zur Auflösung von 4 Å beobachtet.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:691 |
| Date | January 2003 |
| Creators | Noskov, Andrey |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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