The hereditary transthyretin (TTR) amyloidoses are rare, and in severe cases, fatal disorders caused by mutations in the TTR gene. The clinical picture is diverse, involving neuropathies and myopathies, and mainly depends on the causative mutation and the sites and rates of amyloid deposition. The ultimate aim of the field of research presented in this thesis is to prevent TTR amyloid disease. To reach this ambitious goal, a thorough understanding of the normal as well as the pathological properties of the protein is essential. Here, comparisons between TTR from humans and other species may provide valuable information. The three-dimensional structure of TTR from Gilthead sea bream (Sparus aurata) was determined at 1.75 Å resolution by X-ray crystallography, and was found to be structurally similar to human TTR. However, significant differences were observed in the area at and around β-strand D, an area believed to dissociate from the structure prior to amyloid formation, thereby allowing the β-strands A and B to participate in polymerization. During evolution, the preference of TTR for the thyroid hormones, 3,5,3’-triiodo-L-thyronine (T3) and 3,5,3’,5’-tetraiodo-L-thyronine (T4), has shifted. While human TTR has higher affinity for T4, the opposite is true in lower vertebrates, e.g. fish and reptiles, where T3 is the main ligand. We have determined two separate structures of sea bream TTR in complex with T3 and T4, both at 1.9 Å resolution, as well as the complex of human TTR with T3. A significantly wider entrance and narrower thyroid hormone binding channel suggest a structural explanation to the differences in thyroid hormone preference between human and piscine TTR. The Tyr114Cys substitution in TTR is associated with severe systemic amyloidosis. The mutation introduces a second cysteinyl group in the TTR monomer, and has been shown to inhibit the formation of fibril formation in vitro, promoting the formation of disulfide-bonded amorphous aggregates. To deduce the role of intermolecular disulfide bonds in fibril formation we characterized the TTR Cys10Ala/Tyr114Cys double mutant. Our results suggest that an intermolecular disulfide bond at position 114 enhances the exposure of Cys10, which promotes the formation of additional intermolecular disulfide-linked assemblies. Also, we were able to isolate a disulfide-linked dimeric form of this mutant that formed protofibrils in vitro, suggesting the architecture of TTR amyloid may be the result of different underlying structures rather than that of a highly stringent assembly. We have also been able to successfully adapt a method of protein pre-heating to enable crystallization, thereby succeeding in a particularly problematic protein crystallization experiment. By heating the protein solution, we succeeded in separating several forms of protein micro-heterogeneities from the properly folded protein species, thereby allowing the growth of well diffracting crystals. / Ärftlig transthyretinamyloidos är en ovanlig och i allvarliga fall dödlig proteininlagringssjukdom som orsakas av mutationer i genen för transthyretin. Den kliniska bilden är huvudsakligen beroende av den bakomliggande genförändringen samt amyloidlokaliseringen och -depositionshastigheten och omfattar vanligen neuropatier och myopatier av varierande grad. Det slutgiltiga målet med forskningsfältet som presenteras i denna avhandling är att förhindra eller bota transthyretinamyloidos. En förutsättning för att lyckas med detta ambitiösa mål är en ingående förståelse för proteinets grundläggande egenskaper, såväl i normalfallet som i de patologiska processerna, bland annat genom jämförande studier av humant och icke-humant transthyretin (TTR). Den tredimensionella röntgenkristallografiska strukturen av TTR från fisken guldsparid (Sparus aurata) bestämdes till en upplösning på 1,75Å och befanns vara strukturellt snarlik humant TTR. Signifikanta skillnader observerades emellertid i och kring β-sträng D, en region som tros dissociera från huvudstrukturen innan själva bildningen av amyloid. Enligt denna hypotes leder D-strängsdissociationen till exponering av β-strängarna A och B, vilka därmed kan delta i de reaktioner som bildar amyloid. Under evolutionen har bindningspreferenserna för thyroideahormonerna T3 (3,5,3’-trijod-L-thyronin) och T4 (3,5,3’,5’-tetrajod-L-thyronin) hos TTR ändrats. Humant TTR har högre affinitet för T4 än för T3, medan det motsatta förhållandet gäller för lägre vertebrater, t ex fisk, där T3 är den huvudsakliga liganden. Strukturerna bestämdes för guldsparid i komplex med T4 och med T3 till 1,9 Å upplösning, samt för humant TTR i komplex med T3 till 1,7 Å upplösning. Jämförande analyser visade på signifikanta skillnader i thyroideahormonbindningskanalen, vilken var vidare och grundare i fisk än i människa. Dessa strukturella skillnader kan delvis förklara olikheterna i hormonbindning mellan högre och lägre vertebrater. Substitutionen Tyr114Cys i TTR är kopplad till en allvarlig form av systemisk transthyretinamyloidos. Mutationen introducerar en andra cysteinylgrupp i TTR-monomererna, vilket förhindrar fibrillbildning in vitro, men gynnar bildningen av amorfa disulfidbundna aggregat. För att närmare studera betydelsen av disulfidbindningar vid fibrillbildning av detta protein så karakteriserades dubbelmutanten TTR Cys10Ala/Tyr114Cys. Baserat på våra resultat föreslår vi att intermolekylära disulfidbindningar i position 114 ökar exponeringen av Cys10, vilket förstärker tendensen att bilda ytterligare disulfidbundna aggregat. Vi isolerade även en disulfidbunden dimerisk form av dubbelmutanten som kan bilda protofibriller in vitro. Baserat på denna observation föreslår vi att transthyretinamyloids underliggande arkitektur är sammansatt och kan nås genom sammanfogning av olika substrukturer snarare än genom en strikt ordnad uppbyggnad. Vi har också modifierat och anpassat en metod för uppvärmning av proteiner för att möjliggöra kristallisation i ett synnerligen problematiskt proteinkristallisations-experiment. Genom uppvärmning av proteinlösningen lyckades vi separera olika former av mikroheterogeniteter från det rättveckade proteinet, som sedan bildade kristaller av god röntgendiffraktiv kvalitet.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UPSALLA1/oai:DiVA.org:umu-1507 |
| Date | January 2008 |
| Creators | Karlsson, Anders |
| Publisher | Umeå universitet, Umeå centrum för molekylär patogenes (UCMP) (Teknisk-naturvetenskaplig fakultet), Umeå : Umeå centrum för molekylär patogenes (UCMP) (Teknisk-naturvetenskaplig fakultet) |
| Source Sets | DiVA Archive at Upsalla University |
| Language | English |
| Detected Language | Swedish |
| Type | Doctoral thesis, comprehensive summary, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, text |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0051 seconds