La sécrétion de vasopressine (AVP) et de corticolibérine (CRH) déclenchent la sécrétion d'ACTH via leurs récepteurs V1B et CRF1, puis celle des catécholamines et des corticostéroïdes, résultant dans les effets physiologiques induits par le stress. Trois mutations résultant de variants non-synonymes affectant le récepteur V1B (K65N, R364H et G191R) ont été associées chez l'homme à des troubles psychiatriques tels que la phobie, l'hyperactivité et le comportement suicidaire. Nous avons étudiés les propriétés pharmacologiques de ces variants V1B qui pourraient être la cause de ces pathologies. Après construction de chacun des plasmides codant pour chaque variant, nous les avons exprimés dans des cellules HEK293 et avons établi les caractéristiques de chaque récepteur telles que son affinité de liaison, ses couplages à la PLC, à la MAP kinase et la mobilisation du Ca2+. Nous avons observé que le variant R191 avait un couplage à la PLC et à la MAP kinases fortement augmenté (+50%), alors que les autres variants montraient un baisse de ces couplages. Les différences n'étant pas dûes à des constantes d'activation (Kact) pour l'AVP différents. L'association avec les β-arrestines n'est pas équivalente pour tous les variants, le R191 montrant une forte association aux β-arrestines 1 et 2 alors que le variant N65 ne s'associe plus. Ces données indiquent que le déficit en ERK-phosphorylée peut être dû à la fois à une baisse de la production d'Inositol-P et de DAG via la voie Gq et à une baisse de signalisation directe via les β-arrestines. Nous avons également examiné les propriétés d'internalisation de ces variants en utilisant des lignées cellulaires stables exprimant chacun des récepteurs couplés à une EGFP. Nous avons observé, par microscopie confocale, que la cinétique et le taux d'internalisation étaient similaires pour tous les variants. Par contre, la voie du traffic intracellulaire est modifiée pour certains. Les variants possédant la mutation C terminale H364 (H364 et N65/H364) sont préférentiellement adressés à la voie de dégradation lysosomiale alors que les autres utilisent la voie classique de recyclage endosomial comme le récepteur sauvage, ainsi que le révèlent les marquages spécifiques de ces compartiments. En conclusion, les résultats obtenus durant cette thèse révèlent que les variants du récepteurs V1B trouvés chez des patients atteints de troubles affectifs ont des propriétés pharmacologiques de couplage et de trafic intracellulaire modifiées. Ces mutations pourraient participer à une plus grande vulnérabilité des patients au stress. Ainsi, elles pourraient être recherchées, à titre de marqueurs génétiques, chez des patients considérés comme à risque.Cette thèse translationnelle a été financée par un contrat doctoral CHRU/UM1. / The release of vasopressin (AVP) and corticoliberin (CRH) triggers the release of ACTH by the mean of V1B and CRF1 receptors, releasing catecholamines and corticosteroids and regulating stress. Genetic modifications of either element may produce severe consequences. Three non-synonymous variants of the V1B receptor gene were found in patients with phobia, hyperactivity or suicidal conducts (respectively K65N, R364H and G191R). To explore the pharmacological properties of these V1B variants, we generated and expressed in HEK293 cells cDNA constructs of each variant. We evaluated ligand affinity, PLC coupling, MAP kinase activation, Ca2+ mobilization. The capacity of R191 variant to accumulate inositol phosphates and to activate MAP kinase under AVP activation was higher as compared to N65 and H364 variants. However, all variants exhibited the same Kact for AVP. V1B variants were not similar in β-arrestin interaction either, with N65 variant impaired for this function, indicating that the deficit in ERK phosphorylation measured previously may result of 2 additional mechanisms, one due to a lower IP/DAG production with impaired coupling to Gq, and the other due to a decrease in β-arrestin interaction. Finally, we compared internalization properties using stable cell lines expressing EGFP–tagged V1B variants and confocal microscopy. First, we observed no difference neither in the internalization kinetics nor in amplitude (70% of total receptors internalized). However, H364 variant showed a different trafficking as compared to K65/G191/R364 (“wt”) and N65, with less cytoplasmic recycling endosomes and more lysosomial addressing as revealed by Lamp1 co-labelling.Altogether, these data reveal that V1B receptor variants in phobic and suicidal patients display modified coupling and/or desensitization processes. These mutations could participate to a predisposition to depression and could be used as diagnosis genetic markers in risky patients.M Manière's Ph.D Scholarship was granted on a translational CHRU/UM1.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2015MONTT022 |
| Date | 07 October 2015 |
| Creators | Manière, Maxime |
| Contributors | Montpellier, Corbani, MaIthé, Courtet, Philippe |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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