La membrane bactérienne a fait l'objet de nombreuses études de localisation de protéines et de phospholipides. Par fusion d’une protéine fluorescente (GFP) aux gènes d’intérêt, il est alors possible d‘observer la localisation des protéines associées par microscopie. La plupart de ces observations ont été réalisées à l’aide de microscopes dits à épifluorescence. Afin d’obtenir une qualité d’image suffisante, il était nécessaire de surexprimer la protéine observée, insérée à un locus ectopique non naturel. Ce travail de thèse a permis d’utiliser une nouvelle technologie acquise dans notre laboratoire, le microscope à fluorescence par réflexion totale interne (TIRFM), plus puissant que le microscope à épifluorescence utilisé précédemment. Cette technologie a permis une caractérisation plus détaillée de la localisation de protéines d’intérêt, placées sous contrôle de leur promoteur naturel. Il a également été possible de caractériser la dynamique des foci observés. Nous avons concentré notre étude sur 3 protéines: (i) SecA pour l’étude de la translocation des protéines du cytoplasme vers la membrane, (ii) YidC pour l’insertion des protéines dans la membrane, (iii) PgsA pour la synthèse des phospholipids. Les foci se déplacent dynamiquement et s’associent de manière transitoire dans la membrane. L’observation sur la durée de ces foci, et l’analyse de leur intensité moyenne au cours des observations, montre que SecA se déplace sur l’ensemble de la membrane de manière uniforme. L’analyse du déplacement des foci montre une relation quadratique entre la distance moyenne parcourue par les foci en fonction du temps. Ce résultat est en accord avec l’hypothèse d’un mouvement brownien des foci. Les foci sont observés dans les différentes phases de croissance des cellules, et le nombre de foci présents dans une cellule de la longueur de celle-ci. SecA-GFP a été testés dans un certain nombre de contextes génétiques. La localisation a été perturbée lors de la déplétion de pgsA. Cependant, comme PgsA est une protéine essentielle, il ne peut être exclu que ce changement de localisation apparaît des cellules qui sont mortes ou mourantes. Dans une souche mutante ΔclsA, on n’observe aucune différence dans la localisation de SecA en phase exponentielle, mais on aperçoit une relocalisation aux poles en phase stationnaire de croissance. La voie Tat est responsable du transport des protéines devant être exportées dans un état structuré, par exemple dans le cas de l’incorporation d’un co-facteur. À ce jour, la régulation du système Tat est peu connues, de même que les interactions entre les différentes sous-unités du système Tat et d'autres protéines dans le cytoplasme, dans la membrane ou dans la paroi cellulaire. Des fusions de les gènes de la voie Tat ont été co-exprimées deux à deux dans des cellules de levure, et leur capacité à interagir in vivo a été testée par la méthode dite du double hybride chez la levure. Nous avons généré un réseau d’interaction autour des cinq composants de système Tat. Pour déterminer les implications fonctionnelles des composants du réseau, nous avons travaillé en collaboration avec le laboratoire de Jan-Maarten van Dijl. Nous avons utilisé une collection de souches mutantes pour lesquels certains composants individuels du réseau ont été retires. Trois a été observe d’etre nécessaires pour la sécrétion Tat-dépendante. Nous avons étudié la localisation des fusions GFP avec ces proteins. On a observé une localisation double de HemAT selon l’état physiologique de la cellule. En phase exponentielle, les cellules de B. subtilis sont généralement présentes sous forme de chaînes dans lesquelles le septum de division a déjà été formé, mais la séparation cellulaire n'a pas encore eu lieu. Une fusion de la GFP à CsbC apparaît de façon homogène dans la membrane. / In the years since the cloning of GFP, the field of bacterial cell biology has characterized a variety of specific protein localization patterns in the bacterial membrane. The vast majority of early subcellular localization studies made use of inducible GFP fusions, which generally required the presence of high concentrations of inducer, and can therefore be considered to be overexpressed. An outstanding question remains over the organization of natively expressed proteins in the membrane. Here, we have investigated the localization of functional GFP fusions to proteins catalyzing important membrane processes; the secretion motor protein SecA, the membrane insertase YidC1, and the essential phospholipid synthase PgsA using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). This allowed natively expressed proteins to be localized with temporal resolution that can capture their dynamics. We characterized dynamic complexes dispersed throughout the membrane displaying diffusive movement with no preferred trajectories. Further characterization focused upon identifying conditions in which the localization pattern was disturbed. A polar mislocalization was identified in a cardiolipin mutant strain. The yeast two-hybrid (Y2H) approach is a robust approach to detect binary interactions on a proteome-scale. We performed genome-wide Y2H screens as well as targeted Y2H analyses for specific interactions involving components of the Sec and Tat secretion machineries of B. subtilis, revealing an intricate protein-protein interaction network involving 71 proteins. Furthermore, three proteins identified in the Tat network, WprA, CsbC and HemAT, were shown to be important for effective protein secretion via the B. subtilis Tat system, indicating that our yeast two hybrid assays reveal biologically significant interactions involving membrane proteins. The studies provide a novel proteomic view on the interaction network of the secretion systems of B. subtilis.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2013PA112122 |
| Date | 16 July 2013 |
| Creators | Mackichan, Calum |
| Contributors | Paris 11, Carballido-Lôpez, Rut |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text, Image, MovingImage |
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