<i>Arabidopsis thaliana</i> trichomes exhibit strong birefringence under polarized light, a characteristic of cell walls containing large amounts of highly ordered cellulose microfibrils. The <i>tbr1</i> mutant of <i>Arabidopsis</i> lacks trichome birefringence and is deficient in secondary cell wall cellulose synthesis (Potikha and Delmer, 1995). The <I>TBR</i> gene was identified by recombinational mapping, candidate gene sequencing and molecular complementation using genomic cosmid clones, as well as a p35S:<I>TBR</i> genomic DNA construct, fully rescuing the mutant phenotype in both cases. The only mutant allele available (<i>tbr-1</i>) carries a substitution (G to E) in a conserved aminoacid domain of the protein. <br><br>
<I>TBR</i> gene structure was proved to have a longer size than the one found to be annotated at the time of identification in the data-base. A full cDNA clone containing the full transcript was available and also complementation experiments using different gene fragments (annotated and suggested) leaded to the result that TBR gene is indeed, longer. <I>TBR</i> encodes a novel plant-specific protein with predicted plasma membrane localization, therefore being consistent with idea that is required for-, or is a novel component of a functional cellulose synthase complex. <I>TBR</i> is part of an Arabidopsis gene/protein family, (TBL-trichome birefringence like) which, depending on homology, comprises up to 20 members, none of which has a biological or biochemical function attributed.<br><br>
T-DNA insertion lines in <I>TBR</i> gene and two close homologues have been screened by PCR, but no homozygous were found and no trichomes phenotype was identified. Promoter-GUS lines were produced for <I>TBR</i>, as well as for its two closest homologues (one being a segmentally duplicated gene on chromosome III), using 1.6-2 kb of promoter sequence upstream of the annotated start codons. The <I>TBR</i> promoter was the only one of the three that yielded trichome expression, this probably explaining the phenotype of the <i>TBR</i> mutant. Moreover, <I>TBR</i> is expressed in leaves, in growing lateral roots, and in vascular tissues of young <i>Arabidopsis</i> seedlings and plantlets. Later on, the expression appears in inflorescens, stems, flowers and green siliques. This expression pattern is largely overlapping with those of the two analyzed homologues and it corresponds with data of RT-PCR expression profiling performed for <I>TBR</i> and the two analyzed homologues in different tissues, at different developmental stages. Biochemical analysis of cell wall (leaves and trichomes), as GC and MALDI-TOF, were performed, but revealed no major differences between tbr1 and wild type plants. Scanning electron microscopy analysis and cell wall polysaccharides antibody labeling showed a clear difference in the trichomes cell wall structure between mutant plant and wild type. / Genetische Kartierung und molekulare Charakterisierung der tbr-Mutante in <i>Arabidopsis thaliana</i>. <br><br>
Arabidopsis Trichome zeigen eine starke Doppelbrechung unter polarisiertem Licht, ein charakteristisches Merkmal der Sekundärzellwand, die aus großen Mengen parallel angeordneten Zellulose-Mikrofibrillen besteht.
In der Arabidopsis tbr-Mutante ist die Synthese der Sekundärzellwand fehlerhaft. Die Trichome der tbr-Mutante zeigen unter polarisiertem Licht den Doppelbrechungseffekt nicht (Potikha and Delmer, 1995). <br><br>
TBR ist ein pflanzenspezifisches Protein, das in der Plasmamembran lokalisiert ist. Diese Tatsache lässt vermuten, dass TBR eine Rolle bei der Zellulose-Synthese spielt oder Teil des Zellulose-Synthese Komplexes ist. Die TBR Genfamilie besteht aus 20 Genen, deren biologische oder biochemische Funktion nicht bekannt ist.<br><br>
Das TBR Gen wurde durch „recombinational mapping“ und Sequenzierung identifiziert. Die molekulare Komplementation erfolgte unter Verwendung von Cosmidklonen und einem p35S:TBR genomischen DNA-Konstrukt und konnte den Wildtypphänotyp wieder vollständig herstellen. Die tbr-1 Mutante trägt einen Basenaustausch (G nach A) in einer hochkonservierten Aminosäuresequenz im Protein. In einer Arabidopsis T-DNA Linie mit Insertion in einem Exon konnten in einem PCR-Screen nur heterozygote Pflanzen identifiziert werden. Diese zeigten alle im polarisierten Licht den Doppelbrechungseffekt nicht.
Ein möglicher Hinweis für den Phänotyp der tbr-Mutante könnte die Expressionsanalyse durch ein Promotor-GUS Konstrukt sein. Hierfür wurde eine 1,6 kb Sequenz, die upstream des TBR Startcodons liegt verwendet. Es zeigte sich, dass die Expression in den sowohl in den Trichomen zu finden war, als auch in Blättern, der Seitenwurzel und in vaskulären Gewebe junger Arabidopsis Keimlinge. In späteren Entwicklungsstadien ist eine Expression in den Stämmen, Blüten und grünen Schoten sichtbar. Diese Ergebnisse konnten durch RT-PCR Expressionsprofile und anhand der AtGenExpress Daten verifiziert werden.
Zellwandanalysen durch GC und MALDI-TOF der Blätter und Trichome zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen der tbr-Mutante und Wildtyppflanzen. In den Pektinen der primären Zellwand konnten Unterschiede durch Immunolabeln der Zellwände festgestellt werden. <br><br>
Lokalisationsanalysen wurden mit Hilfe von C- und N-terminalen GFP-Konstrukten durchgeführt. Es konnte kein Signal detektiert werden. Mit Hilfe der Konstrukte konnte jedoch der Wildtyp Phänotyp wieder hergestellt werden. <br>
Es konnte also gezeigt werden, dass durch die genetische Kartierung und molekulare Charakterisierung des TBR Gens, ein an der Synthese der Zellulose beteiligtes Gen gefunden wurde.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:Potsdam/oai:kobv.de-opus-ubp:599 |
| Date | January 2005 |
| Creators | Nita, Ana-Silvia |
| Publisher | Universität Potsdam, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät. Institut für Biochemie und Biologie |
| Source Sets | Potsdam University |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | Text.Thesis.Doctoral |
| Format | application/pdf |
| Rights | http://opus.kobv.de/ubp/doku/urheberrecht.php |
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