Les Norovirus (NoV), appartenant à la famille des Caliciviridae, sont une cause majeure dépidémies et de cas sporadiques de gastroentérites hautement contagieuses chez lhomme. Leur transmission emprunte la voie fécale-orale et ils sont à l'origine dune part importante des toxi-infections humaines d'origine alimentaire, en particulier dues à la consommation de mollusques bivalves. Ils possèdent un génome constitué dARN monocaténaire de polarité positive et sont classeés par analyse de proximité génétique en cinq génogroupes, contenant chacun plusieurs génotypes.
Un problème majeur réside dans lincapacité à multiplier facilement les NoV en culture de cellules. La RT-PCR est devenue la méthode de choix pour leur détection dans les échantillons de matières fécales, les denrées alimentaires et les prélèvements effectués dans lenvironnement. Il est important de disposer de techniques à la fois sensibles et permettant également la détection dun large panel de NoV. La quantification de la charge virale est possible par lutilisation des techniques de RT-PCR en temps réel et est primordiale pour non seulement déterminer le niveau de contamination dun prélèvement, mais également pour étudier et caractériser la pathogénie de linfection à NoV.
Des NoV ont été détectés dans diverses espèces animales, dont lespèce bovine. Ces découvertes ont soulevé d'importantes questions sur une éventuelle transmission zoonotique et l'existence d'un réservoir animal pour les NoV. La caractérisation moléculaire des deux prototypes de NoV bovins, nommément le virus Newbury2 et le virus Jena, a révélé qu'ils étaient génétiquement proches et associés aux NoV humains. Parmi les hypothèses évoquées, les animaux pourraient être soit des porteurs passifs de NoV, soit infectés de manière active par ces virus, responsables dès lors d'une zoonose. Caractériser les NoV circulant chez lhomme et les espèces animales est intéressant dans le but détudier leurs voies de transmission et léventuel passage inter-espèce de ces virus.
Un mécanisme important d'évolution des NoV est la recombinaison, dun grand intérêt dans létude des NoV, générant des modifications du génome viral aboutissant à la création dun génome « chimère » à partir de deux génomes parentaux différents. Elle crée ainsi de la variation génétique et par là lémergence de nouveaux virus. En effet, il est bien documenté que la recombinaison se produit souvent parmi les NoV et contribue à la diversité génétique de ces virus ainsi quà lapparition de nouvelles épidémies. La prévalence des souches de NoV recombinants peut être sous-estimée par le fait que la caractérisation des NoV est habituellement basée sur le séquençage partiel du gène de lARN polymérase-ARN dépendante uniquement, alors quidéalement il faudrait séquencer différentes parties du génome, principalement lARN polymérase-ARN dépendante et la protéine de capside, pour identifier de tels virus. Il est important de déterminer précisément l'implication exacte de la recombinaison sur lévolution des NoV afin de comprendre les mécanismes dévolution des souches et l'avantage sélectif conféré pour certaines dentre elles. Etudier ce mécanisme permettra de mieux comprendre lavantage sélectif observé pour certains NoV et aidera à élucider les voies de transmission des NoV.
Létude de ces deux points (transmission zoonotique et virus recombinants) est primordiale. En effet, le franchissement de la barrière despèce affecterait à la fois l'épidémiologie et l'évolution de ces virus, et compliqueraient également la capacité au développement dun vaccin ou dun traitement. Dans d'autres espèces animales, comme les chevaux ou les oiseaux, aucun NoV na été détecté à ce jour mais ces dernières années, des NoV ont été décrits dans de nombreuses espèces animales (chien, lion, mouton). Cela laisse donc présager dune gamme despèce cible encore plus étendue.
Ce travail sinscrit dans le cadre de létude des voies de transmission des NoV avec comme objectif, après la mise au point de méthodes rapides et sensibles de détection et de quantification, dapporter un éclaircissement aux questions importantes relatives à lévolution des NoV et à leur catégorie dhôte.
Dans un premier temps, la RT-PCR conventionnelle a été utilisée afin de détecter les NoV dans les espèces humaine et bovine. Ensuite, une RT-PCR utilisant la technologie SYBR Green a été développée et utilise un contrôle interne constitué dARN ajouté au même tube. Ce test est capable de détecter des NoV humains et bovins appartenant aux génogroupes I, II et III et permet de faire la distinction entre les NoV et le contrôle interne par lanalyse des courbes de dissociation. Une dilution 10 fois des échantillons sest révélée la méthode de choix pour lever les inhibitions.
Afin de pouvoir confirmer directement le résultat et de permettre la quantification des NoV, une RT-PCR en temps réel utilisant la technologie TaqMan a été développée. Elle utilise un contrôle interne dARN et un standard dARN. De façon très intéressante, cette méthode peut détecter les NoV humains appartenant au génogroupes I, II et bovins du génogroupe III. Les inhibitions furent efficacement levées par une dilution 10 fois de léchantillon ou lajout de sérum albumine bovine au mix de RT-PCR.
Ces deux RT-PCR en temps réel ont montré une sensibilité supérieure comparée à la RT-PCR conventionnelle.
Avec pour objectif de comprendre les voies de transmission des NoV, la situation en Belgique a été investiguée et des NoV humains et bovins ont été détectés et analysés par séquençage partiel. Des NoV appartenant à différents génogroupes ont été détectés : GI et GII chez lhomme et GIII chez les bovins. Par analyse de la proximité génétique, les NoV bovins se sont révélés de génotype GIII.2 et les NoV humains de différents génotypes, mais majoritairement de génotype GII.4.
Ces analyses ont permis également lidentification dune co-infection et de deux recombinants naturels, ces derniers étant proches de génotypes différents en fonction de la région du génome analysée (polymérase ou capside). L'identification de zones privilégiées pour la recombinaison dans la région située à la jonction de l'ORF (open reading frame) 1 et de lORF2 confirme l'importance de cette région dans ce phénomène.
Afin détudier lévolution des NoV bovins, un NoV bovin détecté en Belgique fut séquencé complètement (Bo/B309/2003/BE) et comparé à la souche originale Newbury2 (isolée dans les années 80).
Dune part, cette études a permis daboutir à la mise au point et la validation doutils permettant la détection et létude les NoV humains et animaux, tant pour leur pathogénie, que leur évolution ou leurs voies de transmission.
Dautre part, basée sur le panel déchantillons recueillis durant cette étude, lanalyse phylogénétique des NoV détectés va dans le sens des études réalisées dans dautres pays tendant à montrer que les NoV bovins constituent un groupe de virus distincts, différents des NoV humains. Cela suggère que les NoV bovins ne représentent pas un risque pour la santé humaine. Néanmoins, la possibilité dune infection zoonotique ou dun réservoir animal ne peut pas être exclue vu la proximité de séquence entre les NoV humains et animaux et aussi la relation étroite et proche entre les populations humaines et les élevages danimaux.
La détection dune co-infection et de deux recombinants naturels démontre les possibilités dévolution des NoV et limportance dune analyse complète de leur génome pour leur caractérisation.
Ce travail a été pionnier dans létude des NoV au laboratoire et a ouvert la voie à dautres sujets de recherche sur les NoV et à de nouvelles thèses de doctorat, notamment sur létude de linteraction NoV-hôte (NoV dans lespèce bovine) et létude de la recombinaison des NoV in vitro (NoV murins).
| Identifer | oai:union.ndltd.org:BICfB/oai:ETDULg:ULgetd-05272009-224121 |
| Date | 25 May 2009 |
| Creators | Scipioni, Alexandra |
| Contributors | Charlier, Carole, Lekeux, Pierre, Bureau, Fabrice, Gillet, Laurent, Desmecht, Daniel, De Mol, Patrick, Thiry, Etienne, Daube, Georges, Goubau, Patrick, China, Bernard, Uyttendaele, Mieke, Drion, Pierre-Vincent |
| Publisher | Universite de Liege |
| Source Sets | Bibliothèque interuniversitaire de la Communauté française de Belgique |
| Detected Language | French |
| Type | text |
| Format | application/pdf |
| Source | http://bictel.ulg.ac.be/ETD-db/collection/available/ULgetd-05272009-224121/ |
| Rights | restricted, Je certifie avoir complété et signé le contrat BICTEL/e remis par le gestionnaire facultaire. |
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