La scoliose est la déformation de la colonne vertébrale la plus répandue. Elle atteint
3 à 4% de la population pédiatrique et dans 85% des cas, aucune cause n’a été identifiée.
Ces cas sont appelés idiopathiques et les symptômes apparaissent durant la puberté; d’où le
terme de ‘scoliose idiopathique de l’adolescent (SIA). Cette pathologie atteint le plus
souvent les jeunes filles, en nombre et en sévérité. Ces dernières années, plusieurs
hypothèses ont été proposées afin d’élucider l’étiologie de cette pathologie. Celles-ci ont
mis de l’avant différents facteurs génétiques, biochimiques, mécaniques, neurologiques,
musculaires ou hormonaux. Plusieurs études ont rapporté des formes familiales de scoliose,
soutenant la thèse d’une prédisposition génétique. Nous avons démontré que les patients
souffrant de SIA présentent un défaut de signalisation cellulaire médiée par les protéines Gi
et un taux élevé d’ostéopontine (OPN) circulante. En utilisant une approche de type ‘gène
candidat’, nous avons montré que la protéine tyrosine phosphatase μ (PTPμ) régule
l’activité du complexe d’intégrines α5/β1 (récepteur de l’OPN) via la protéine kinase
PIPKIγ. Dans ce but, nous avons utilisé des cultures primaires d’ostéoblastes issues de
biopsies de patients et de cas traumatiques comme sujets contrôles. Les biopsies osseuses de patients ont été obtenues lors de l’intervention chirurgicale à partir des vertèbres T3 à L4, selon les différentes procédures. Les biopsies issues de cas traumatiques proviennent d’autres types d’os (tibia, crête iliaque, fémur). Les profils d’expression du gène PTPRM (codant pour la protéine PTPμ) ont été étudiés par PCR quantitative (qPCR). Les taux de protéines PTPμ ont été analysés par immunoprécipitation suivi d’un western blot. Pour évaluer le rôle de cette protéine, nous avons bénéficié d’un modèle murin. Machida et al. ont démontré qu’il existe un taux plus élevé de scoliose parmi les souris C57Bl/6 bipèdes obtenues suite à l’amputation des membres supérieurs, sous anesthésie, cinq semaines après la naissance. Nous avons utilisé des cultures primaires d’ostéoblastes issues de la colonne ii vertébrale de souris C57Bl/6 bipèdes, délétées du gène PTPRM (souris dites ‘KO’), afin d’évaluer le niveau de signalisation cellulaire spécifique des protéines Gi par un test fonctionnel: la technique de spectroscopie cellulaire di-électrique (SCD). Selon nos données, 85% des souris bipédales ‘KO’ pour le géne PTPRM développent une scoliose (modérée à sévère) contre 55% des souris contrôles C57Bl6 bipèdes. De plus, les niveaux de PTPμ exprimée par les ostéoblastes de 34 patients SIA se trouvent diminués par comparaison à 17 sujets contrôles. Nos études de souris bipèdes ont montré que l’inactivation du gène PTPRM augmente l’incidence et la sévérité de la scoliose, sans pour autant affecter les taux circulant d’OPN ou l’expression de ses récepteurs. Par ailleurs, dans ce même contexte, nous avons remarqué une augmentation de l’interaction entre l’OPN et
l’intégrine β1 en l’absence du gène PTPRM. Les cellules issues de ces souris bipèdes KO
montrent une réduction dans leurs niveaux de signalisation cellulaire médiée par les
protéines Gi après stimulation par l’OPN. Cette diminution est en grande partie récupérée
après traitement des cellules par un siRNA spécifique de la protéine PIPK1γ, substrat de
PTPμ qui favorise la fixation de ligands aux intégrines. Ces études apportent les premières indications que la perte d’expression de PTPμ est impliquée dans le développement de la SIA, en amplifiant probablement l’effet inhibiteur de l’OPN sur la signalisation cellulaire médiée par les protéines Gi.
Ces études permettent une meilleure compréhension de l’étiologie de la SIA. Elles
pourraient avoir une contribution importante dans le développement futur de méthodes
diagnostique et thérapeuthique dans le but d'arrete l’apparition et l’évolution de la maladie
chez les enfants atteints. / Adolescent idiopathic scoliosis (AIS) is the most common form of scoliosis that
affects 3-4% of the global pediatric population. In more than 85% of cases, no specific
cause can be identified. Such cases are called idiopathic and occur mostly during
adolescence. AIS affects mainly females in number and severity. Over the past years, many
hypotheses were proposed to explain the etiology of AIS, including genetic, biochemical,
mechanics, neurological, muscular and hormonal factors. Several studies have reported a
high incidence of scoliosis in some families, which argues for a genetic cause of this
disease. We demonstrated that AIS patients have a Gi protein signaling defect and exhibit
high levels of circulating Osteopontin (OPN). The goal of this thesis is to identify the
mechanisms regulating OPN signaling activity in AIS patients. We have used a candidate
gene driven approach and discovered that protein tyrosine phosphatase μ (PTP μ) regulates
α5β1 integrin (a known OPN receptor) through phosphate kinase type 1 gamma (PIPK1γ).
To achieve our goal, we have used primary osteoblast cell cultures derived from AIS
patients and biopsies from control subjects. Bone specimens were obtained intraoperatively
from vertebras (varying from T3 to L4 according to the surgical procedure performed)
while with trauma cases used as non-scoliotic controls, bone specimens were obtained from
other anatomical sites (tibia, femur or iliac crest). Expression profiles of the RPTPM gene
(encoding for PTPμ) were studied by qPCR. On the other hand, PTPμ protein levels were
determined by immunoprecipitation followed by western blot. To evaluate the role of this
protein in AIS etiopathogenesis, we took advantage of an animal model exhibiting a higher
scoliosis incidence when maintained in a bipedal state. [1], [2] Bipedal surgeries were
performed on C57Bl/6 mice after weaning (5-weeks after birth) by amputation of the
forelimbs and tail under anesthesia as reported by Oyama et al. (2006). [1] We used the
same approach with PTPμ knockout mice and primary osteoblast culture were derived from the spine of these mice to assess Gi protein signaling through a functional assay termed
Cellular Dielectric Spectroscopy (CDS).
Bipedal PTPμ knockout mice develop scoliosis more often (85%) in number and
severity, than control C57Bl/6 bipedal mice (55%). Interestingly, functional analysis of
osteoblasts derived from PTPμ KO mice by CDS method showed a flaw in the transmission
of Gi protein coupled receptor signaling similar to a specific AIS patient subgroup.
Furthermore, the clinical relevance of PTPμ was strengthened by the fact that a decrease in
the gene expression level of PTPμ was observed in 34 AIS patients when compared to 17
control subjects. Such a decrease was also confirmed at the protein level. We demonstrated
that genetic deletion of PTPμ enhances the incidence and severity of scoliosis without
affecting plasma levels of OPN or the expression of its receptors. In contrast, increased
interaction of OPN with β1 integrin was noticed in cells depleted of PTPμ. Furthermore,
reduction of Gi- protein coupled receptor GiPCR signaling by OPN was also enhanced in
these cells, while their response to GiPCR stimulation was improved with siRNA of
phosphatidylinositol-phosphate kinase type 1 gamma (PIPK1γ), a PTPμ substrate that
favours ligand binding to integrins. These studies provide the first indication that the loss of
PTPμ influences the nature of idiopathic scoliosis, possibly by amplifying the inhibitory
effect of OPN on GiPCR signaling.
This study allows a better understanding of AIS etiology and could have an impact
for the future development of innovative diagnostic methods and eventual pharmacological
approaches in order to prevent AIS and stop its progression in affected children.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:umontreal.ca/oai:papyrus.bib.umontreal.ca:1866/11338 |
| Date | 04 1900 |
| Creators | Elbakry, Mohamed |
| Contributors | Moreau, Alain |
| Source Sets | Université de Montréal |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Thèse ou Mémoire numérique / Electronic Thesis or Dissertation |
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