El propósito de esta Tesis Doctoral ha sido profundizar y ampliar los conocimientos sobre la distribución, biosíntesis y metabolismo de las furanocumarinas e isoflavonas en B. bituminosa. La importancia y el interés por estos metabolitos secundarios reside en su aplicabilidad en biomedicina, ya que al ser irradiadas con luz UV, establecen uniones covalentes con el ADN y con proteínas, modulando, la regulación génica o la actividad de determinados enzimas. Ha demostrado ser efectivo contra distintas enfermedades autoinmunes y diversos tipos de cáncer. Por otro lado, las isoflavonas, son consideradas moduladores selectivos del receptor de estrógenos (SERM´s), pudiendo estar implicadas tanto en el crecimiento como en la muerte celular. Uno de nuestros objetivos, ha sido la de encontrar un material vegetal, con una producción lo suficientemente alta como para establecerse como materia prima para la producción comercial de estos compuestos, y B. bituminosa ha mostrando uno de los mayores niveles de FC´s e isoflavonas de todos los materiales vegetales analizados. Durante el presente trabajo, se ha optimizado un método analítico, rápido, preciso y eficaz, y se han analizado los niveles de FC´s e isoflavonas, de distintas variedades y poblaciones de B. bituminosa, por toda la cuenca mediterránea e Islas Canarias. Seleccionando aquellas, que presentaban una biosíntesis mayoritaria de FC´s lineales y por otro lado, individuos con una biosíntesis mayoritaria de FC´s angulares. Se establecieron plantaciones experimentales, de las cuales surgieron dos clones de B. bituminosa, clon Psoraleno (96% de FC´s lineales) y B. bituminosa, clon Angelicina (75% de FC´s angulares). Se estudió tanto la evolución en la acumulación de FC´s como su distribución en planta, así como la modulación de su ruta biosíntética. Observándose un patrón de distribución característico, donde las FC´s se localizan predominantemente en la parte aérea de la planta, mientras que las isoflavonas, se localizan en la parte radicular, siendo inducidas ambas moléculas, por determinados precursores, como el ácido cinámico o umbeliferona, por metales como el Mg2+ o el Cu2+ y por algunos efectores hormonales como el MeJa. Además se ha identificado, purificado y caracterizado bioquímica y molecularmente una enzima, implicada directamente en el metabolismo de las FC´s, como es una ß-glucosidasa específica de furanocumarinas glicosiladas, (BbFCbG), la cual, pertenece a la familia 1 de las glicosil hidrolasas. Esta enzima, presenta una alta especificidad por las FC´s conjugadas, debido a la sustitución de un residuo de ácido glutámico, en el centro activo, por uno de glutamina. Este hecho ocurre con sustratos que tienen una reactividad lo suficientemente alta como para no necesitar catálisis ácida, y en el caso de las furanocumarinas, la catálisis básica recaería sobre el grupo hidroxilo del grupo carboxilo presente en el anillo lactona de la propia furanocumarina, lo que podría ser la razón de la elevada especificidad de esta enzima por las furanocumarinas. Esta enzima además, está implicada en la respuesta defensiva frente a heridas, mostrando una inducción de su transcripción al realizar heridas en la planta o al tratarla con MeJa. Por último, se llevó a cabo un estudio del metabolismo de FC´s durante el proceso germinativo y se analizó cómo varían los niveles de BbFCbG durante dicha etapa del desarrollo vegetal, mostrando una hidrólisis de FC´s conjugadas en los cotiledones, así como un aumento en la expresión de esta enzima en ese órgano. Además, en la activación de BbFCbG están implicadas fitohormonas como el GA3 y el MeJa y en menor medida la 6-BA. Para el desarrollo de estos objetivos se han utilizado numerosas técnicas de instrumentación científica (HPLC, MS/MS, TOF, RMN), así como técnicas bioquímicas y moleculares, las cuales, nos han permitido avanzar en el conocimiento del metabolismo de estos compuestos. / SUMMARY The aim of this PhD Thesis has been deepen and broaden the knowledge about the distribution, biosynthesis and metabolism of furanocoumarins (FC´s) and isoflavones in B. bituminosa. The importance and interest of these secondary metabolites is its aplicability in biomedicine, such to be able to, when they are irradiated with UV light, to establish covalents unions with both DNA and proteins, modulating gene regulation or activity of certain enzymes, which has been demostrated to be effective agains various autoinmune diseases and cancers. Furthermore, isoflavones are considered selective estrogen receptor modulators (SERM´s) and they may be involved in both cell growth and cell death. One of our goals in this report, has been to find a plant material, with a high enough production of these metabolites in order to establish itself as raw material for commercial production of these compunds and so B. bituminosa has been shown one of the highest amounts of FC´s and isoflavones content in the analyzed plant kingdom. In this work, it has been optimized an analytical, fast, accurate and efficient method for quantification of differents FC´s and isoflavones, previously identified in B. bituminosa. In addition, It has done a prospecting, analyzing FC´s and isoflavones levels of several varieties and populations of B. bituminosa throughout the mediterranean basin and Canary Islands, selecting all of them, that met with our requirements: a majority biosynthesis of linear FC´s, or angular FC´s. We have been established two experimental plantations with selected plants, in which, we selected two plants to be candidates, one of them, called Psoralen clone (96% linear FC´s content) and other one, called, Angelicin clone (75% angular FC´s content). It has been studied the evolution in FC´s accumulation, their distribution in plants and the modulation of the biosynthetic pathway. We observed a characteristic pattern of distribution, where FC´s are located predominantly in the aerial parts of the plants while isoflavones are located in the root part of the plant, being both molecules induced by certain precursors, such as cinnamic acid and umbelliferone, by metals, such as Mg2+ or Cu2+ and some hormonal effectors as MeJa. Otherwise, it has been identified, purified and characterized an enzyme directly involved in the metabolism of the FC´s, as specific ß-glucosidase of furanocoumarins (BbFCbG), which belongs to family 1 of glycosyl hidrolases. This enzyme has a high specifity againts conjugate FC´s, due to the sustitution of a glutamic acid residue, located at the active site of the enzyme, by a glutamine one. This fact occurs with substrates that have a reactivity high enough to not require acid catalysis, and with furanocoumarins, base catalysis would be carried out by the hydroxyl group, content in the carboxyl group of lactone ring in FC´s. These could be the reason of the highest specifity of this enzyme on furanocoumarins. This reaction mechanism, is the first time that it is purposed, as well as, the identification and characterization of an furanocoumarin conjugated specific ß-glucosidase. Also, this enzyme is involved in the defense response to wounds, showing an induction of its transcription when made tissue damage or by treatment with MeJa. Finally, we studied about the FC´s metabolism during the germination process and was analyzed the variation of expression levels of BbFCbG during this stage of plant development, showing a FC´s conjugates hydrolysis in cotyledons during development and an increase of the transcription levels of BbFCbG in this organ. Also, in the activation of BbFCbG are implicated some phytohormones as GA3 and MeJa, and to a lesser extent 6-BA. For accomplish these objectives, we have been used numerous scientific instrumentation techniques (HPLC, MS/MS, TOF, RMN), biochemical and molecular techniques, which have allowed us to advance our knowledge of the metabolism of these compounds.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UM/oai:www.tdx.cat:10803/361106 |
| Date | 18 December 2015 |
| Creators | Díaz Expósito, Licinio |
| Contributors | Ortuño Tomás, Ana María, Del río Conesa, José Antonio, Universidad de Murcia. Departamento de Medicina Interna |
| Publisher | Universidad de Murcia |
| Source Sets | Universidad de Murcia |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 264 p., application/pdf |
| Source | TDR (Tesis Doctorales en Red) |
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