Estudos funcionais anteriores identificaram um módulo cis-regulador (MCR) de 67 pb (-253/- 187) na região promotora do gene de pufe de DNA BhC4-1 que dirige a expressão do gene repórter na glândula anelar de Drosophila melanogaster. Uma análise bioinformática identificou 67 sequências de D. melanogaster que são similares a sequências contidas no MCR de glândula anelar. Uma das sequências identificadas reside em um fragmento genômico de 657 pb localizado aproximadamente 2500 pb à montante do CG13711, 400 pb à montante do CG12493, em uma região genômica que constitui um dos íntrons do CG32239 (Gef64C). A caracterização preliminar de três linhagens transformadas com a construção 657 pb-lacZ mostrou expressão do gene repórter no sistema traqueal de larvas e prépupas e no tórax de adultos. Baseado padrão de expressão promovido por este MCR, o mesmo foi denominado Traqueia-Tórax (TT). O principal objetivo do presente trabalho constituiu estender a caracterização molecular das linhagens da série TT-lacZ. Inicialmente embriões, larvas de primeiro, segundo e terceiro estádio, prépupas 0 h, 1 h e 2 h, pupas 24 h e adultos com 1, 3 e 5 dias foram investigados quanto ao padrão de expressão do repórter utilizando ensaio histoquímico que detecta atividade de ?-galactosidase. A expressão do gene repórter é inicialmente detectada no sistema traqueal durante o terceiro estádio larval e continua a ser detectada neste tecido em prépupas 0 h, 1 h e 2 h e pupas 24 h. Em adultos, a expressão do gene repórter é verificada nos músculos longitudinais dorsais em adultos de 3 e 5 dias. Uma vez que o MCR TT reside em uma região intergênica e a informação disponível sobre os CGs próximos ainda é escassa, não foi possível inferir qual dos CGs é regulado pelo MCR TT. Neste contexto, o padrão de expressão do RNAm do gene repórter lacZ e do CG13711, CG12493 e CG32239 foi investigado no sistema traqueal de larvas e prépupas e no tórax de adultos de uma das linhagens da série TT-lacZ utilizando RT-qPCR. Os níveis de expressão do RNAm lacZ aumentam cerca de 3 vezes em prépupas 0 horas, quando comparados com os níveis de expressão do RNAm lacZ presentes no sistema traqueal de larvas de terceiro estádio. Um padrão de expressão similar foi observado no caso do CG32239 e do CG13711. Nos tóraxes de adultos de 3 e 5 dias de idade os níveis de expressão do RNAm lacZ aumentam cerca de 37 vezes e 11 vezes, respectivamente, quando comparados aos níveis de expressão iv do RNAm lacZ presentes nos tóraxes de adultos de 1 dia. No tórax de adultos, o único CG que apresenta um padrão de expressão similar ao padrão de expressão de lacZ constitui o CG12493. Em conjunto, nós concluímos que o MCR TT promove um padrão dinâmico de expressão durante o desenvolvimento. Além disso, com base nos resultados de RT-qPCR, nós sugerimos que o MCR TT regula a expressão do RNAm do CG32239 no sistema traqueal durante a transição larva-prépupa e também a expressão do RNAm do CG12493 no tórax de adultos de 3 e 5 dias de idade. Além de estender a caracterização funcional de um novo MCR, nossos resultados também contribuem com novas informações acerca dos padrões de expressão no desenvolvimento de três CGs de D. melanogaster. / Previous functional studies identified in the DNA puff BhC4-1 promoter region a 67 bp (- 253/-187) cis-regulatory module (CRM) that drives reporter gene expression in the ring gland of D. melanogaster. A bioinformatics analysis identified 67 Drosophila melanogaster sequences that are similar to sequences contained in the ring gland CRM. One of the identified sequences resides in a 657 bp genomic fragment located about 2500 bp upstream CG13711, about 400 bp upstream CG12493, in a genomic region that constitutes one of the introns of CG32239 (Gef64C). The preliminary characterization of three transgenic lines transformed with a 657 bp-lacZ construct revealed reporter gene expression in the larval/prepupal tracheal system and in adult thorax. Based on the pattern of expression driven by this CRM we named it Trachea-Thorax (TT). The main goal of this work was to extend the molecular characterization of the lines of the TT-lacZ series. Initially ?-galactosidase histochemical assays were performed in embryos, first, second and third instar larvae, 0h, 1h and 2h prepupae, 24 h pupae and 1, 3 and 5 days old adults. Reporter gene expression is initially detected during the third larval instar in the tracheal system and continues to be detected in this tissue at 0 h, 1h and 2 h prepupa and, 24 h pupa. During the adult stage, reporter gene expression is verified in the dorsal longitudinal muscles of 3 and 5 days old adults. Since the TT CRM lies in an intergenic region and the available information about the nearby CGs is still scarce it was not possible to infer which of the CGs is regulated by the TT CRM. In this context, the mRNA pattern of expression of the lacZ reporter gene and of CG13711, CG12493 and CG32239 was investigated in the tracheal system of both larvae and prepupae and in adult thoraxes of one of the transgenic lines of the TT-lacZ series using RTqPCR. The lacZ mRNA expression levels increase about 3 times in 0 h prepupae when compared to the lacZ mRNA expression levels present in the tracheal system of third instar larvae. A similar pattern of expression was observed for both CG32239 and CG13711. In three and five days old adult thoraxes lacZ mRNA expression levels increase about 37 times and 11 times, respectively, when compared to lacZ mRNA expression levels present in one day old thoraxes. In the adult thorax, the only CG that presents a similar pattern of expression constitutes CG12493. Overall, we conclude that the TT CRM drives a dynamic pattern of ii expression throughout development. Additionally, based on RT-qPCR results, we suggest that the TT CRM regulates the expression of CG32239 mRNA in the tracheal system during the larvae to prepupae transition, as well as the expression of CG12493 mRNA in the thorax of 3 and 5 days old adults. Besides extending the functional characterization of a novel CRM our results also contribute new information about the developmental patterns of expression of three Drosophila melanogaster CGs.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-06062017-163006 |
| Date | 07 November 2016 |
| Creators | Wester, Jorge Victor Wilfredo Cachay |
| Contributors | Monesi, Nadia |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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