Hemolytic disease of fetus or newborn (HDFN) är en komplikation där foster eller nyföddas erytrocyter förstörs för tidigt. HDFN uppstår när det föreligger blodgruppsinkompatibilitet mellan moder och barnet. Komplikationerna/ symptomen kan variera allt från mildare symptom till fosterdöd. HDFN orsakas framförallt av antikropp D (RhD-immunisering) och på grund av detta utförs det typning av fetalt RhD i maternell plasma. Utöver RhD-immuniseringar kan svåra fall av HDFN ibland orsakas av andra blodgruppssystem som c (Rh) och K (Kell). Fetal RhD-typning görs idag som screening på alla RhD-negativa gravida mödrar och utförs i Stockholm och Lund. Metoden som används är baserad på realtids-PCR och har använts sedan 2009. Fetal typning av c och K görs när höga titrar av anti-c respektive anti-K påvisas i mammans plasma. För fetal typning av c och K skickas prover från Huddinge till Lund respektive Amsterdam. Motsvarande immunisering mot erytrocytantigen kan även bildas mot trombocytantigen främst Human Platelet Antigene (HPA-1a) som uttrycks hos fostret och leda till fetal neonatal alloimmun trombocytopeni (FNAIT). En next generation sequencing (NGS) baserad metod för genomisktypning av alla kliniskt relevanta blodgruppssystem finns idag på Karolinska universitetssjukhuset. Denna metod är dock inte anpassad för fetal blodgruppstypning där cell-fritt foster- DNA (cffDNA) analyseras. Syftet med det här projektet var att optimera designade oligonukleotider (oligos) anpassade för fetal blodgruppstypning med NGS-metodik. Design av oligos utfördes innan examensarbetet påbörjades. Dessa inkluderade primer- par som amplifierar upp alla blodgruppssystem som kan orsaka HDFN och FNAIT. Utöver det inkluderade designade oligos markörer som amelogenin-XY (Amel-XY) som är könsspecifika markörer och insertion/deletion markörer (Indel-markörer). Med Amel-XY markörerna kan könsspecifika Y-genen påvisas i provet, vilket kommer att fungera som en kontroll på att foster-DNA har analyserats (fungerar endast vid manligt foster). Designade Indel-markörer består av 2 - 3 bp insertioner/deletioner där olika markörerna används till att skilja DNA från foster och modern i framtiden. De designade oligonukleotiderna undersöktes för om de ger tillräckligt bra amplifiering av sökta sekvenser med NGS genom att analysera två slumpmässigt valda försöksprover (genomisk DNA 2 ng/ μL) från en man och en kvinna. Resultatet visade att tillräckligt bra amplifieringar/signaler erhålls från samtliga markörer som ingår i studien. Den totala signalen för samtliga markörer blev 114234 läsningar (”reads”) vilket gav ett medelvärde på 3939 läsningar. För att mäta amplifieringsförmågan hos varje enskild markör beräknades procent av medelvärdet på 3939 läsningar. En signal på 20 – 180 % av medelvärdet ansågs vara godkänt för varje markör. Alla undersökta primer-markörer uppvisade en signal på minst 45 % av medelvärdet vilket var godkänt (godkänt intervall 20 – 180 %). Efter optimering av oligos som ger tillräckligt bra amplifiering genotypades 32 slumpmässigt valda DNA prover från 21 män och 11 kvinnor med hjälp av NGS. Efter NGS-körning och analys av fastQ-filer med hjälp av mjukvaruprogrammet R erhölls resultat i form av signaler. Signaler för respektive markör över 50 läsningar ansågs vara en positiv signal det vill säga att den sökta genen har påvisats. Signal-värde under 50 innebar att det förekom bakgrundssignal då önskat signal-värde vid avsaknad av sökt gensekvens är 0 (åsatt gränsvärde <1 % av högst uppmätta positiva signalen för varje markör). Samtliga undersökta markörer visade låg bakgrundssignal (<1 % ). Bakgrundssignalen beräknades för att veta vilken tillförlitlig nivå varje markör ska ligga på för att kunna detektera känsligt foster-DNA i framtiden. Resultaten i denna studie visade att de optimerade oligos kan användas till genotypning av cffDNA i framtiden eftersom markörerna uppvisade låga bakgrundssignaler vilket indikerar att metoden är tillräckligt effektiv för att kunna detektera känsligt foster-DNA i framtiden.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UPSALLA1/oai:DiVA.org:lnu-106208 |
| Date | January 2021 |
| Creators | Mohamed, Bashir |
| Publisher | Linnéuniversitetet, Institutionen för kemi och biomedicin (KOB) |
| Source Sets | DiVA Archive at Upsalla University |
| Language | Swedish |
| Detected Language | Swedish |
| Type | Student thesis, info:eu-repo/semantics/bachelorThesis, text |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0019 seconds