Der unselektive Kationenkanal TRPC6 (transient receptor potential canonical 6) wird durch den second messenger Diacylglycerol (DAG) aktiviert und spielt eine wichtige Rolle bei einer Vielzahl physiologischer und pathophysiologischer Prozesse. Um neuartige Therapien zu ermöglichen, ist die Identifizierung potenter und selektiver Kanalmodulatoren von großem Interesse. Die vorliegende Dissertation widmet sich der Identifizierung, Optimierung und Charakterisierung neuer Inhibitoren sowie Aktivatoren des TRPC6-Ionenkanals.
Im ersten Teil der Arbeit werden aufbauend auf früheren Studien diverse Modifikationen am Grundgerüst des TRPC6-selektiven terpenoiden Naturstoffs (+)-Larixol vorgenommen, um eine umfassende Struktur-Wirkungsbeziehung zu erstellen. Die Derivate werden durch fluorometrische Ca2+-Influx-Analysen sowie elektrophysiologische patch clamp-Untersuchungen in HEK293-Zellen mit stabiler Überexpression der Kanäle TRPC6, TRPC3 und TRPC7 charakterisiert. Die potenteste Verbindung Larixyl-N-methylcarbamat Lab-19 weist eine 16-fach
höhere TRPC6-Affinität als die Leitstruktur (+)-Larixol und 4-fache bzw. 13-fache Selektivität gegenüber den nah verwandten Ionenkanälen TRPC7 und TRPC3 auf. Die Inhibition von nativ exprimierten TRPC6-Kanalkomplexen wird durch die Anwendung von Lab-19 in pulmonalen glatten Gefäßmuskelzellen der Ratte demonstriert. Weiterhin führt die Behandlung von isolierten, perfundierten Mauslungen mit Lab-19 zu einer Reduktion des Ischämie-Reperfusionsödems, einer lebensbedrohlichen Komplikation bei Lungentransplantationen.
Der zweite Teil beschreibt das Screening einer 16.671 Substanzen umfassenden
Wirkstoffbibliothek nach potentiellen Kanalaktivatoren und deren Charakterisierung. Die Beschreibung und Synthese der vielversprechendsten Verbindung C20 aus dieser Studie erfolgt in einem dritten Teil der Arbeit. C20 wirkt selektiv auf TRPC6, was die Substanz von bisherigen Aktivatoren wie OAG (1-Oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol) unterscheidet, welche auch die Ionenkanäle TRPC3 und TRPC7 aktivieren. Eingehende Untersuchungen mithilfe von Ca2+-Assays und
elektrophysiologischen Experimenten zeigen, dass C20 als positiv allosterischer Modulator agiert und eine Kanalaktivierung verstärkt. Die Verbindung C20 wird schließlich in humanen Thrombozyten getestet, für welche eine Expression von TRPC6 beschrieben ist. Die Kombination von OAG und C20 führt zu einem signifikant höheren Anstieg des intrazellulären Calciums in Thrombozyten verglichen mit einer gewöhnlichen Antwort auf OAG-induzierte Aktivierung. Diese
Beobachtungen unterstreichen die Eignung des identifizierten positiven Modulators C20 als zukünftiges selektives Demaskierungswerkzeug für TRPC6-Signale in nativen Geweben.:Inhaltsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis III
Schemataverzeichnis IV
Tabellenverzeichnis V
Abkürzungen VI
1 EINLEITUNG 1
1.1 DIE FAMILIE DER TRP-IONENKANÄLE 2
1.2 DER TRPC6-KATIONENKANAL 7
1.2.1 Struktur und Regulation 7
1.2.2 Physiologische Relevanz 8
1.3 MODULATOREN DES TRPC6-IONENKANALS 9
1.3.1 Aktivatoren 11
1.3.2 Inhibitoren 14
1.3.3 TRPC6-Inhibition durch Larixolderivate 16
2 ZIELSTELLUNG 19
3 EXPERIMENTELLER TEIL 21
3.1 CHEMISCHE SYNTHESEN 21
3.1.1 Reagenzien und Lösungsmittel 21
3.1.2 Analytische Methoden 21
3.1.3 Synthesen 23
3.2 BIOLOGISCHE METHODEN 43
3.2.1 Reagenzien, Lösungsmittel und Puffer 43
3.2.2 Aktivatoren, Inhibitoren, Pharmaka 44
3.2.3 Verbrauchsmaterialien 44
3.2.4 Zellkultur 45
3.2.5 Transiente Transfektion 45
3.2.6 Bestimmung der Zellviabilität 46
3.2.7 Fluoreszenz-Imaging 47
3.2.8 Elektrophysiologie 51
3.2.9 Analyse des Ischämie-Reperfusions-Ödem in isolierten Mauslungen 53
3.2.10 Isolierung humaner Thrombozyten 54
3.2.11 Aggregometrie 54
3.2.12 Datenanalyse 53
4 ERGEBNISSE 55
4.1 SAR-STUDIE NATURSTOFFBASIERTER TRPC6-KANAL-INHIBITOREN 55
4.1.1 Isolierung des Naturstoffes Larixol aus dem Lärchenharz 55
4.1.2 Erstellung einer labdanbasierten Substanzbibliothek 56
4.1.3 SAR-Daten der Inhibition von TRPC3, TRPC6 und TRPC6 60
4.1.4 Auswirkung der Larixolderivate auf die Zellviabilität 69
4.1.5 Subtypspezifität von Larixylmethylcarbamat 69
4.1.6 Elektrophysiologische Charakterisierung der TRPC3/6/7-Inhibition durch Lab-19 73
4.1.7 Wirkung von Larixylmethylcarbamat auf Zellen mit endogener TRPC6-Expression 75
4.1.8 Diskussion 76
4.2 IDENTIFIZIERUNG POSITIVER TRPC6-IONENKANALMODULATOREN 82
4.2.1 Hochdurchsatz-Screening der ChemBioNet-Bibliothek 82
4.2.2 Funktionelle Charakterisierung von 46-J17 88
4.2.3 Diskussion 90
4.3 CHARAKTERISIERUNG DES POSITIVEN ALLOSTERISCHEN TRPC6-MODULATORS 93
4.3.1 C20 induziert transienten Ca2+-Einstrom in HEKhTRPC6-YFP-Zellen 93
4.3.2 C20 – ein positiver TRPC6-Modulator 97
4.3.3 Untersuchung mechanistischer Aspekte der TRPC6-Potenzierung 100
4.3.4 Aktivierung des TRPC6 im physiologischen System 103
4.3.5 Diskussion 106
5 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK 111
6 LITERATUR 115
Appendix
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:34666 |
| Date | 24 July 2019 |
| Creators | Häfner, Stephanie |
| Contributors | Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/acceptedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 10.1002/cmdc.201800021, 10.1016/j.ceca.2018.12.009 |
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