Das 20S Proteasom ist das Kernelement des Ubiquitin-Proteasom-Systems und baut fehlerhafte, nicht mehr benötigte und oxidierte Proteine ab, wobei drei katalytisch aktive Untereinheiten die Polypeptidkette schneiden. Das proinflammatorische Cytokin IFNg induziert die Expression und Inkorporation der alternativen katalytisch aktiven Immunountereinheiten, was in variablen Isoformen des 20S Proteasoms resultiert. Die zusätzliche Assoziation des 19S Regulators, bzw. des PA28 und des PA200 Aktivators an eine Isoform erweitert das Sortiment an proteasomalen Komplexsubtypen. Der zeitliche Verlauf einer IFNg Stimulation zeigte, dass die Aktivatoren PA28 und PA200 antagonistisch an das 20S Proteasom assoziieren und niedermolekulare Komplexsubtypen bilden, sodass in dieser Studie auch zum ersten Mal eine IFNg abhängige Assoziation des PA200 Monomers an das 20S Proteasom detektiert wurde. Ex vivo Versuche zeigten, dass die Defizienz der Immunountereinheit LMP7 mit der Assoziation des PA28-Aktivators an das 20S-19S Proteasom kompensiert wird, wobei die funktionelle Wirksamkeit aber offen bleibt. In einer monozytären Zelllinie wird ein sehr hochmolekularer, chymotryptisch aktiver Komplex assembliert und massenspektrometrische Analysen detektierten proteasomale Untereinheiten und viele Komponenten der Proteinbiosynthese, was für eine Assoziation des Proteasoms mit dem Polysom spricht. Diese Möglichkeit der kotranslationalen Degradation kann auch die Assoziation des detektieren Chaperonins TriC erklären, wobei dieser Komplex, der ATP abhängig Proteine faltet, möglicherweise auch direkt mit dem Proteasom interagieren könnte, wie elektronenmikroskopische Aufnahmen belegten. Neben den neuen strukturellen Ergebnissen, bestätigte die funktionelle Analyse den Abbau polyubiquitinierter Substrate durch 19S-Regulator assoziierte Komplexsubtypen, doch das 19S-20S-19S Proteasom konnte das Modellsubstrat HA-Ubi-IkBa-flag besser abbauen und deubiquitinieren als das 20S-19S Proteasom. / The 20S proteasome is the core element of the ubiquitin-proteasome-system, which degrades defective, unneeded and oxidized proteins, while three catalytically active subunits hydrolyze the peptide bonds of the polypeptide. The proinflammatory cytokine IFNg induces the expression and incorporation of three alternative, catalytically active immunosubunits resulting in variable isoforms of the 20S proteasome. The additional association of the 19S regulator, or the PA28 and PA200 activator, respectively, expands the range of proteasome complex subtypes. The time course of IFNg stimulation showed that the proteasomal association of PA28 and PA200 occurs antagonistically, forming low molecular weight complex subtypes. Furthermore, this study revealed for the first time an IFNg dependent association of the PA200 monomer to the 20S proteasome. Ex vivo experiments showed that the deficiency of the immunosubunit LMP7 is compensated by the association of the PA28 activator to the 20S-19S proteasome, whereas the functional efficacy remains elusive. In a monocytic cell line, a chymotryptic active complex with a very high molecular weight was detected, and mass spectrometry confirmed proteasomal subunits and components of the protein synthesis machinery, suggesting an association of the proteasome with the polysome. The fact of cotranslational degradation may also explain the association of the chaperonin TriC, an ATP dependent protein folding chaperonin. Electron micrographs could reveal that TriC possibly interacts directly with the proteasome. Next to the new structural results, the functional analysis confirmed the degradation of polyubiquitinated substrates by 19S regulator associated complex subtypes, and in addition to it, the 19S-20S-19S proteasome degraded and deubiquitinated the model substrate HA-Ubi-IkBa-flag better than the 20S-19S proteasome.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:HUMBOLT/oai:edoc.hu-berlin.de:18452/17501 |
| Date | 19 November 2013 |
| Creators | Schächterle, Carolin |
| Contributors | Kloetzel, Peter-Michael, Dubiel, Wolfgang, Saumweber, Harald |
| Publisher | Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I |
| Source Sets | Humboldt University of Berlin |
| Language | German |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralThesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | Namensnennung - Keine kommerzielle Nutzung - Keine Bearbeitung, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de/ |
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