Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein neuartiges 3D Fluoreszenz Mikroskop, OMX gennant, entworfen und gebaut. Ein umfassender Design-Neuansatz erlaubt es den neuen Anforderungen der aktuellen Biologie bezüglich erhöhter Auflösung in Zeit und Raum Rechnung zu tragen. Mit Ausnahme vom Auflegen des Objektträgers sind alle Aspekte des Mikroskops Computer-gesteuert. Einen Großteil der Software floß in ein neues, eigenständiges Open-Source Projekt ein. Es erlaubt die Verarbeitung sehr großer, mehrdimensionaler Bilddaten, und die Entwicklung neuartiger Algorithmen in einer flexiblen Oberfläche. OMX hat zwei Betriebsarten: Im ersten Modus können bis zu 100 Bilder pro Sekunde mit optischer Auflösung in mehreren Farbkanälen aufgenommen werden. Dies entspricht etwa 10 3D Bildern pro Sekunde. Im zweiten Modus können mit der Structured Illumination Mikroskopie fixierte Präparate mit eine Auflösung unterhalb des Abbe-Limits untersucht werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit, stelle ich erste Forschungsergebnisse von OMX vor. Drosophila X-chromosomen markiert mit GFP-MSL3 wurden in situ im sub-Sekunden Bereich beobachtet. Mit Hilfe neuentwickelter Algorithmen konnte ich die Chromosomendynamik analysieren. Das Falten und Entfalten von Bereichen eines Chromosoms wurde als Funktion der Zeit darstellen. Chromosomenstrukturen wurden mit Hilfe der SIM an fixierten primären embryonalen Kulturen untersucht. Unterstrukturen von 100-200nm sind erkennenbar. Viele Bilder zeigen eine DNA-reiche Hülle die einen DNA-armen Chromosomenkern umgibt. Ausserdem habe ich polytäne Chromosomen mit SIM aufgenommen. Bandstrukturen zeigen sich mit deutlich erhöhter Detailklarheit, und Längsfasern sind sichtbar, die ansonsten nur vom Elektronenmikroskop her bekannt sind. Als weiteres Beispiel der verbesserten Auflösungsfähigkeit habe ich Kernporen untersucht. In mit DAPI gefärbten Mauszellen zeigen diese sich als dunkle Punkte mit einer Größe von etwa 120nm. / A novel fluorescence 3D wide-field light microscope called OMX, was designed and implemented. The novel design addresses improved speed and resolution requirements of current biology research. After designing and building the microscope body I designed and implemented the needed computer software for the eight computers required to operate OMX. Over the course of the project I also designed and implemented a new Open-Source software platform for algorithm development and image analysis. It focuses on very large multi-dimensional image data handling and visualization in general. OMX can operate in two modes: In the first mode a live specimen can be observed at optical resolution (approx. 250nm) at speeds up to 100 sections per second simultaneously in multiple wavelength channels. This equals about 10 3D images per second. The second mode is for observing fixed preparations at resolutions below the Abbe diffraction limit using Structured Illumination Microscopy (SIM). This produces 3D volumetric image data with lateral resolution near 100nm and axial resolution of about 200nm. In the second part of this thesis I show first results achieved using the OMX microscope. Chromosome dynamics was analyzed using various newly developed image analysis algorithms. Sub-second motion was observed for in situ Drosophila X-chromosomes tagged with GFP-MSL3. Parts of the chromosome can be traced within the nucleus and time-series data shows its folding and unfolding as a function of time. Chromosome structure was imaged using SIM on formaldehyde fixed primary embryonic cultures stained with DAPI. Features of the sub-structure with sizes around 100-200nm were apparent. Many chromosomes show an outer layer along the chromatin axis appearing persistently denser in DNA than the central core. Polytene chromosomes were imaged using SIM. Band patterns are visible in much more detail than in conventional deconvolution microscopy and longitudinal fibers known only from electron microscopy were visible.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:HUMBOLT/oai:edoc.hu-berlin.de:18452/16386 |
| Date | 07 March 2008 |
| Creators | Haase, Sebastian |
| Contributors | Saumweber, Harald, Kam, Zvi, Leonhard, Heinrich |
| Publisher | Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I |
| Source Sets | Humboldt University of Berlin |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralThesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
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