Die erwiesene Verbindung der V-ATPase mit Krankheiten wie Osteoporose oder Krebs erfordert die umfassende Analyse des Enzyms und seiner Inhibitoren, um entsprechende therapeutische Ansätze zu ermöglichen. V-ATPasen befinden sich sowohl in Endomembranen eukaryotischer Zellen als auch in Plasmamembranen vieler tierischer Zellen. Strukturell gliedern sie sich in einen membranständigen, protonentranslozierenden VO-Komplex und einen peripheren, ATP-hydrolysierenden V1-Komplex. Über die Kopplung von ATP-Hydrolyse und Protonentransport energetisiert die V-ATPase viele transmembrane Transportprozesse und reguliert den pH-Wert in Organellen und Zellen. Die etablierten Plecomakrolid-Inhibitoren Bafilomycin und Concanamycin, welche schon seit den 1980er Jahren untersucht werden, hemmen die V-ATPase spezifisch in nanomolaren Konzentrationen. In vorangegangenen Arbeiten war der Hauptteil ihrer Bindestelle bereits der c-Untereinheit des VO-Komplexes zugeordnet worden, wobei aber auch die VO-Untereinheit a an der Bindung beteiligt zu sein scheint. In der vorliegenden Arbeit wurde die Bindestelle mit Hilfe von Photoaffinitätsmarkierungen mit neuen Plecomakrolid-Derivaten und der V-ATPase aus Manduca sexta weiter charakterisiert. Dabei wurde bestätigt, dass die Plecomakrolide an die VO-Untereinheit c binden. Außerdem konnte die Beteiligung der VO-Untereinheit a erstmals direkt gezeigt werden. Sie ist vermutlich auf die engen Interaktionen der Untereinheiten innerhalb des VO-Komplexes zurückzuführen, weshalb ein Inhibitionsmechanismus naheliegt, bei dem Bafilomycin und Concanamycin als „Stöckchen im Getriebe“ die Rotation des c-Rings relativ zur a-Untereinheit verhindern.
Mit dem Inhibitor Apicularen wurde in dieser Arbeit erstmals die Bindestelle eines Benzolacton Enamids an der V-ATPase bestimmt. Eine Besonderheit der Benzolacton Enamide ist die Tatsache, dass sie als erste Inhibitor-Klasse die V-ATPasen von Pilzen nicht hemmen. Nach Kenntnisstand zu Beginn dieser Arbeit binden die Benzolacton Enamide zwar innerhalb des VO-Komplexes, aber an anderer Stelle als die Plecomakrolide und der Inhibitor Archazolid. Überraschenderweise wurden aber bei Photoaffinitätslabelversuchen mit einem Diazirinyl-Derivat von Apicularen ebenfalls die VO-Untereinheiten a und c markiert. Es konnte bestätigt werden, dass sich die Apicularen-Bindestelle deutlich von der des Archazolids unterscheidet, sie jedoch teilweise mit der Plecomakrolid-Bindestelle überlappt. Für die weitere Untersuchung der Apicularen-Bindung wurden Komplementationsstudien mit Deletionsmutanten von Saccharomyces cerevisiae und VO-Untereinheiten Apicularen-sensitiver Organismen durchgeführt. Während der funktionelle Austausch der a-Untereinheit gegen Hybrid-a-Untereinheiten aus S. cerevisiae und Homo sapiens nicht glückte, resultierte der Austausch der c-Untereinheit gegen Homologe von H. sapiens und M. sexta in vollständig assemblierten und aktiven Hybrid-V-ATPasen. Damit gelang es erstmals, eine humane V-ATPase-Untereinheit in Hefe funktionell zu exprimieren. Dadurch, dass die Hybrid-V-ATPasen nicht durch Apicularen gehemmt werden, kann angenommen werden, dass die Apicularen-Bindestelle zumindest nicht von der c-Untereinheit allein gebildet wird, sondern dass im Umkehrschluss die VO-Untereinheit a einen erheblichen Beitrag zur Bindung beisteuert.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-osnabrueck.de/oai:repositorium.ub.uni-osnabrueck.de:urn:nbn:de:gbv:700-2013012810673 |
| Date | 28 January 2013 |
| Creators | Osteresch, Christin |
| Contributors | Prof. Dr. Helmut Wieczorek, Prof. Dr. Karlheinz Altendorf |
| Source Sets | Universität Osnabrück |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf, application/zip |
| Rights | http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/ |
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