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Previous issue date: 2017-02-24 / CAPES / Os papilomavírus incluem vírus de DNA circular, geralmente envolvidos em lesões benignas do epitélio e mucosas. No entanto, alguns papilomavírus apresentam potencial oncogênico levando ao desenvolvimento de doenças como a papilomatose bovina. Atualmente, é sabido que a proteína L2 que compõe a estrutura do capsídeo, e alguns de seus epítopos são capazes de induzir a produção de anticorpos neutralizantes. Além disso, a oncoproteína E5 é responsável pelo crescimento e transformação celular, sendo o principal gene de transformação em bovinos. Entretanto, não existe disponível vacina comercial eficaz contra a infecção pelo BPV. Dessa forma, o presente trabalho consiste na construção de candidatos vacinais por meio de vacina de DNA contra a infecção por BPV. Para tal, tivemos como objetivo específico a construção de vetores vacinais a partir do plasmídeo pCI-neo e avaliamos in vitro a expressão dos respectivos antígenos em células de mamíferos. Os genes escolhidos para o estudo, L2 selvagem e o seu epítopo contido entre os aminoácidos 11 a 200, além do oncogene E5 selvagem, foram amplificados por PCR, clonados individualmente no vetor plasmidial pGEM-T easy e propagados em Escherichia coli (linhagem DH5α). Em seguida, os genes de trabalho foram previamente digeridos e subclonados no vetor pCI-neo para expressão em células de mamífero, incluindo o gene E5 sintético códon otimizado. Ambas as sequências foram avaliadas por digestão enzimática e por sequenciamento. A avaliação da funcionalidade das construções foi realizada pela expressão das mesmas em cultura de células embrionárias do Rim Humano (HEK-293 - Human embrionic kidney cell) seguida por análise da expressão gênica via RT-PCR e dos extratos proteicos por SDS-PAGE e Western-Blot. Os resultados obtidos apresentaram a expressão dos genes L2ʷᵗ, L2¹¹⁻²⁰⁰ e E5ᵒᵗⁱᵐⁱᶻᵃᵈᵒ confirmada por RT-PCR. No entanto, a produção das respectivas proteica não foi detectada pela análise via immunoblotting, demonstrando que melhorias no protocolo são necessárias. / Papillomaviruses are circular DNA viruses, generally involved in benign lesions of the epithelium and mucous membranes. However, some papillomaviruses present oncogenic potential leading to the development of diseases such as bovine papillomatosis. Currently, it is known that the viral capsid L2 protein and some of its epitopes are capable of inducing the production of neutralizing antibodies. In addition, the E5 oncoprotein is responsible for cell growth and transformation, being the main transformation gene in cattle. However, no effective commercial vaccine against BPV infection is available. Thus, the present work consists of the construction of vaccine candidates by means of DNA vaccine against BPV infection. For this propose, we specifically aimed to construct vaccine vectors from the plasmid pCI-neo and evaluated the expression of the respective antigens in vitro in mammalian cells. The genes chosen for the study, the entire L2 sequence and its epitope contained between the amino acids 11 to 200 and the wild-type E5 oncogene, were amplified by PCR, individually cloned into the pGEM-T easy vector and propagated in Escherichia coli (strain DH5α). Then, the working genes were pre-digested and subcloned into the pCI-neo vector for expression in mammalian cells, including the synthetic codon optimized E5 gene. Both sequences were evaluated by enzymatic digestion and sequencing. The evaluation of the functionality of the constructs was performed by gene expression in Human Kidney embryo cell (HEK-293) followed by analysis of the gene transcription via RT-PCR and of protein extract via SDS-PAGE and Western Blot. The results obtained showed the expression of the genes L2ʷᵗ, L2¹¹⁻²⁰⁰ and E5ᵒᵖᵗⁱᵐⁱᶻᵉᵈ confirmed by RT-PCR. However, production of the respective proteins was not detected by immunoblotting analysis, demonstrating that improvements in the protocol are required.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufpe.br:123456789/26368 |
| Date | 24 February 2017 |
| Creators | CAMPOS, Ana Paula Ferreira |
| Contributors | http://lattes.cnpq.br/3473903684822728, FREITAS, Antonio Carlos de, CORDEIRO, Marcelo Nazario |
| Publisher | Universidade Federal de Pernambuco, Programa de Pos Graduacao em Genetica, UFPE, Brasil |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPE, instname:Universidade Federal de Pernambuco, instacron:UFPE |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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