Les vecteurs lentiviraux (LV) sont des outils efficaces de transfert de gène, largement utilisés en thérapie génique, en particulier pour la transduction ex vivo de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (CSPH). Afin d’étudier simultanément la fusion et la transduction dans les CSPH avec les LV, nous avons adapté une méthode basée sur latechnologie du transfert d’énergie entre deux molécules fluorescentes (FRET). Pour mettre en place cette technique, des LV capables d’incorporer spécifiquement une enzyme, la bétalactamase (BLAM-LV) et de coder une forme tronquée du récepteur au facteur de croissance nerveuse (DELTA-NGFR), sont produits. Nos résultats montrent que les LV sont soumis à une restriction post-entrée forte dans les cellules hématopoïétiques, que ce soit dans des lymphocytes T immortalisés ou bien des CSH CD34+. Nous montrons également que cette inhibition post-entrée peut être partiellement saturée après une forte augmentation de la multiplicité d’infection ou en présence d’additifs de culture, comme la Vectofusin-1® ou laRetronectin®. De plus, nous avons montré lors de la transduction de CSPH avec des vecteurs BLAM-LV que la Vectofusin-1® agit sur l’étape d’entrée en augmentant l’adhésion et la fusion entre les membranes virale et cellulaire. Cette technique représente donc un nouvel outil sensible et efficace pour étudier de façon concomitante l’étape de fusion et le niveau de transduction dans les cellules cibles. A terme, ce travail permettra une meilleure compréhension de la biologie des LV mais pourra également conduire à l’élaboration de protocoles de transduction lentivirale plus efficaces. / Lentiviral vectors (LV) are used for various gene transfer applications, notably for hematopoietic gene therapy, but methods are lacking to precisely evaluate parameters that control the efficiency of transduction in relation with the entry of vectors into target cells. We adapted a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based HIV-1 fusion assay to measure the entry of non-replicative recombinant LV in various cell types, including primary human hematopoietic stem and progenitor cells, and to quantify the level of transduction of he same initially-infected cells. The assay utilizes recombinant LV containing betalactamase (BLAM)-Vpr chimeric proteins (BLAM-LV) and encoding a truncated form of thelow affinity nerve growth factor receptor (DELTA-NGFR). This LV-based fusion/transduction assay is a dynamic and versatile tool, revealing for instance the extent of lentiviral post-entry restrictions occuring in cells of hematopoietic origin. The assay also shows that transduction enhancers like Vectofusin®-1 or Retronectin® can partially relieve this post-entry block but their effects differ in the way to promote LV entry. Furthermore, our results show that Vectofusin®-1 acts at the entry step by promoting the adhesion and the fusion between lentiviral and cellular membranes. In conclusion, one such assay should be useful to study hematopoietic post-entry restrictions directed against LV and should allow improvements in various LV-based gene therapy protocols.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2013EVRY0021 |
| Date | 29 November 2013 |
| Creators | Ingrao, Dina |
| Contributors | Evry-Val d'Essonne, Fenard, David |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text, Image, StillImage |
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