CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Bothropoides erythromelas à responsÃvel por muitos acidentes no Nordeste do Brasil. O veneno desta serpente induz insuficiÃncia renal aguda. Rins isolados de ratos Wistar, pesando 250 a 300g, foram perfundidos durante 120 min com soluÃÃo Krebs-Henseleit contendo 6g% de albumina bovina. O veneno total de Bothropoides erythromelas foi estudado anteriormente (SOUSA, 2004) e utilizado neste estudo para posterior comparaÃÃo com os grupos tratados com as fraÃÃes PLA2 Lys 49 e Asp 49 do veneno. O veneno total (10mg/mL) e as fraÃÃes PLA2 Lys 49 e Asp 49 (5mg/mL) de B. erythromelas foram adicionados ao sistema 30 min apÃs o inÃcio de cada experimento. Os parÃmetros estudados incluÃram pressÃo de perfusÃo (PP), resistÃncia vascular renal (RVR), ritmo de filtraÃÃo glomerular (RFG), fluxo urinÃrio (FU), percentual de transporte tubular de sÃdio, potÃssio e cloreto (%TNa+, %TK+ e %TCl-), percentual de transporte proximal de sÃdio, potÃssio e cloreto (%pTNa+, %pTK+ e %pTCl-), excreÃÃo de sÃdio, potÃssio e cloreto (ENa+, EK+ e ECl-) e clearance osmÃtico (Cosm) (p< 0,05*). O grupo controle perfundido com albumina foi funcionalmente estÃvel por todos os 120 min. A infusÃo do veneno causou um aumento significante no FU, ENa+, ECl- e Cosm e uma diminuiÃÃo na PP, RVR, %TNa+, %TK+, %TCl-, %pTNa+, %pTK+ e %pTCl-. O RFG e a EK+ diminuÃram aos 60 min e aumentaram aos 90 e 120 min quando comparado com o grupo controle. A infusÃo de Lys 49 causou um aumento significante na PP, FU, ENa+, EK+ e Cosm e diminuiu o RFG e o %TNa+ quando comparada com o grupo controle. Lys 49 nÃo modificou os outros parÃmetros funcionais renais. A infusÃo de Asp 49 modificou apenas os parÃmetros funcionais renais %pTK+ (diminuiÃÃo) e EK+ (aumento) quando comparada ao grupo controle. Lys 49 apresentou um efeito similar ao veneno total nos parÃmetros FU, %TNa+, ENa+, EK+ e Cosm e Asp 49 nos parÃmetros %pTK+ e EK+. A anÃlise histolÃgica mostrou uma quantidade moderada de material proteinÃceo nos glomÃrulos e tÃbulos de rins perfundidos com o veneno, Lys 49 e Asp 49, bem como regiÃes focais de apoptose/necrose em rins perfundidos com Lys 49 e Asp 49. CÃlulas MDCK foram cultivadas em meio de cultura RPMI 1640 suplementado com 10% vv de soro bovino fetal e entÃo avaliadas na presenÃa do veneno total, Lys 49 e Asp 49 de B. erythromelas nas concentraÃÃes (100; 50; 25; 12,5; 6,25 e 3,125mg/mL). A anÃlise dos efeitos citotÃxicos em cÃlulas MDCK foi executada pelo mÃtodo MTT. O veneno promoveu efeito citotÃxico nas concentraÃÃes de 50 e 100mg/mL (IC50 =93,31mg/mL). Lys 49 promoveu efeito citotÃxico nas concentraÃÃes de 6,25; 12,5; 25; 50 e 100mg/mL (IC50 = 38,29mg/mL). Asp 49 promoveu efeito citotÃxico nas concentraÃÃes de 50 e 100mg/mL (IC50 = 158mg/mL). TambÃm foram mensurados os nÃveis de lactato desidrogenase (LDH) e nenhum aumento significante foi observado com veneno total e Asp 49. Lys 49 promoveu um aumento significante nos nÃveis de lactato desidrogenase apenas na concentraÃÃo de 100mg/mL. ApÃs o cultivo de cÃlulas MDCK com o veneno total, nas concentraÃÃes de 46,65 e 23,32mg/mL, foi realizada a reaÃÃo de polimerase em cadeia em tempo real para a avaliaÃÃo da expressÃo de genes prà (Caspase-3, Caspase-8 e Bax) e antiapoptÃticos (Bcl-XL e Mcl-1). NÃo foi realizada avaliaÃÃo da expressÃo de genes prà e antiapoptÃticos com Lys 49 e Asp 49. Na expressÃo de genes prÃ-apoptÃticos o veneno total promoveu um aumento da expressÃo de caspase-3 na concentraÃÃo de 23,32Âg/mL e de caspase-8 nas concentraÃÃes de 46,65 e 23,32Âg/mL, quando comparado com os controles positivo (DOXO) e negativo (PBS) e diminuiu a expressÃo de Bax em ambas as concentraÃÃes. Na expressÃo de genes antiapoptÃticos o veneno total promoveu induÃÃo significativa de Mcl-1 somente na concentraÃÃo de 46,65mg/mL e nÃo modificou a expressÃo de Bcl-XL, quando comparado com o controle negativo. O veneno e as fraÃÃes PLA2 Lys 49 e Asp 49 da serpente Bothropoides erythromelas à capaz de promover significativos efeitos sobre os parÃmetros de funÃÃo renal e sobre cÃlulas MDCK, com indicativo de morte celular por apoptose atravÃs da via extrÃnseca. / Bothropoides erythromelas is responsible for a great deal of snakebites in Northeastern from Brazil. The venom of this snake induces acute renal failure. Isolated kidneys from Wistar rats, weighting 250 to 300g, were perfused with Krebs-Henseleit solution containing 6g% of bovine serum albumin for 120 min. The whole venom of Bothropoides erythromelas been previously studied (SOUSA, 2004) and used in this study for comparison with the treated groups with the PLA2 fractions Lys 49 and Asp 49 of the venom. The whole venom (10mg/mL) and the fractions PLA2 Lys 49 and Asp 49 of B. erythromelas (5mg/mL) were added into the system 30 min after the beginning of each experiment. The parameters studied included perfusion pressure (PP), renal vascular resistance (RVR), glomerular filtration rate (GFR), urinary flow (UF), percent sodium, potassium and chloride tubular transport (%TNa+, %TK+ and %TCl-), percent sodium, potassium and chloride proximal transport (%pTNa+, %pTK+ and %pTCl-), sodium, potassium and chloride excretion (ENa+, EK+ e ECl-) and osmotic clearance (Cosm) (p< 0.05*). The control group perfused with albumin was functionally stable for over 120 min. The infusion of venom caused a significant increase in UF, ENa+, ECl- and Cosm and a decreased in PP, RVR, %TNa+, %TK+, %TCl-, %pTNa+, %pTK+ and %pTCl-. The GFR and the EK+ decreased at 60 min and increased at 90 and 120 min when compared with control group. The infusion of Lys 49 caused a significant increase in PP, UF, ENa+, EK+ and Cosm and decreased the GFR and the %TNa+ when compared with control group. Lys49 did not modify the others functional kidney parameters. The infusion of Asp 49 only modify the functional kidney parameters %pTK+ (decreased) and EK+ (increase) when compared with control group. Lys 49 showed a similar effect at whole venom in parameters UF, %TNa+, ENa+, EK+ and Cosm and Asp 49 in parameters %pTK+ and EK+. The histological analysis showed a mild amount of a proteinaceous substance in the renal tubules and glomeruli of kidneys perfused with the venom, Lys 49 and Asp 49, as well as focal areas of apoptosis/necrosis in perfused kidneys with Lys 49 e Asp 49. MDCK cells were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% vv fetal bovine serum and then assessed in the presence of the whole venom, Lys 49 and Asp 49 of B. erythromelas in the concentrations (100; 50; 25; 12.5; 6.25 and 3.125mg/mL). The analysis of cytotoxic effects on MDCK cells was performed by MTT method. The venom promoted cytotoxic effect in the concentrations of 50 and 100mg/mL (IC50 =93.31mg/mL). Lys 49 promoted cytotoxic effect in the concentrations of 6.25; 12.5; 25; 50 and 100 mg/mL (IC50 = 38.29mg/mL). Asp 49 promoted cytotoxic effect in the concentrations of 50 and 100 mg/mL (IC50 = 158mg/mL). Also the levels of lactic dehydrogenase (LDH) were measured and no significant increase was observed with whole venom and Asp 49. Lys 49 promoted a significant increase in the levels of LDH only in the concentration of 100mg/mL. After culture of MDCK cells with the whole venom, at concentrations of 46.65 and 23.32Âg/mL, was performed the real time polymerase chain reaction for evaluation of pro (Caspase-3, Caspase-8 and Bax) and antiapoptotic (Bcl-XL and Mcl-1) genes expression. The evaluation of pro and antiapoptotic genes expression with Lys 49 e Asp 49 did not realized. In the expression of pro-apoptotic genes the whole venom caused increase of caspase-3 at concentration of 23.32Âg/mL and of caspase-8 at concentrations of 46.65 and 23.32Âg/mL, when compared with negative (PBS) and positive (DOXO) controls and decreased the expression of Bax in both concentrations. In the expression of anti-apoptotic genes the whole venom caused significant induction of Mcl-1 only at a concentration of 46.65Âg/mL and did not modify the expression of Bcl-XL, when compared with the negative control. The venom and the fractions PLA2 Lys 49 e Asp 49 of Bothropoides erythromelas is able to promote significant effects on renal function parameters and on MDCK cells, with indications of cell death by apoptosis through the extrinsic pathway.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.teses.ufc.br:6038 |
| Date | 03 December 2010 |
| Creators | Fabiola Carine Monteiro de Sousa |
| Contributors | Helena Serra Azul Monteiro, Alice Maria Costa Martins, Marcos Hikari Toyama, Renà Duarte Martins, Diva Maria Borges Nojosa |
| Publisher | Universidade Federal do CearÃ, Programa de PÃs-GraduaÃÃo em Farmacologia, UFC, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFC, instname:Universidade Federal do Ceará, instacron:UFC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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