A integridade do DNA é ameaçada pelos efeitos lesivos de inúmeros agentes físicos e químicos que podem vir a comprometer sua função. Um dos mais versáteis e estudados mecanismos de reparo de DNA é o reparo por excisão de nucleotídeos (NER). Este mecanismo remove lesões que causam distorções na dupla fita de DNA, incluindo dímeros de pirimidina ciclobutano (CPDs) e 6-4 fotoprodutos (6-4 PPs), provocados pela radiação de luz ultravioleta (UV). Em humanos, a síndrome genética xeroderma pigmentosum (XP) apresenta uma alta sensibilidade à luz solar, resultando em um grande aumento na incidência de tumores em regiões expostas da pele e degeneração neurológica progressiva. O gene xpa parece estar envolvido diretamente no reconhecimento de lesões produzidas pela luz UV, atuando tanto no reparo global (GGR) como no reparo acoplado à transcrição (TCR). A modulação da expressão deste gene deve alterar as taxas de reparo no genoma celular, fornecendo valiosa contribuição para o estudo do reparo de DNA no NER e em outras vias distintas. No entanto, não foi possível a atenuação ou inativação total do transcrito XPA, provavelmente devido ao baixo número de moléculas de mRNA nas células e da relativa estabilidade da proteína XPA. A expressão controlada do cDNA xpa em células deficientes XP12RO foi conseguida através da transfecção do vetor indutível por muristerona A, pINXA. O clone INXA15M mostrou-se eficiente na indução da proteína XPA, complementando células XP12RO. Quantidades reduzidas de XPA foram suficientes para a complementação total de células XP12RO na sobrevivência frente à luz UV, ou para a atividade de reparo de DNA no genoma global. Entretanto, observou-se uma maior incidência de células apoptóticas em períodos de tempo curtos após a UV, quando comparamos com células proficientes para o reparo de DNA (HeLa). O vetor adenoviral portando o cDNA xpa (AdyXPA) mostrou-se eficiente na complementação de fibroblastos derivados de pacientes XPA. Apesar do curto período de expressão do transgene e da conhecida reação imunológica produzida pelos adenovirus, este vetor representa uma potencial ferramenta para testes de complementação, identificação de mutações e busca de sistemas de correção gênica de pacientes XP. / The DNA integrity is always threatened by the damage effects of physical and chemical agents that could jeopardy its function. The nucleotide excision repair (NER) is one of the most known and flexible mechanisms of DNA repair. This mechanism can recognize and remove DNA double-helix distortion, including the cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs) and the pyrimidine-pyrimidone (6-4) photoproduct, promoted by ultraviolet light (UV). The human syndrome xeroderma pigmentosum (XP) is clinically characterized chiefly by the early onset of severe photosensitivity of the exposed regions of the skin, a very high incidence of skin cancers and frequent neurological abnormalities. The xpa gene seems to be involved during the UV damage recognition, in both global genome repair (GGR) and transcription-coupled repair (TCR). This gene modulation may modify the DNA repair rate in the cell genome, providing valuable contribution to the NER understanding and other DNA repair pathways. However, the complete inactivation or even the attenuation of the XPA transcript was not possible, mainly because of the low abundance mRNA per cell and the high stability of the XPA protein. The controlled expression of the cDNA xpa in XP12RO deficient cells was achieved through the transfection of a muristerone-A inducible vector, pINXA. The INXA15M clone shows good induction of the XPA protein and total complementation of XP12RO cells deficiency. Small quantities of the XPA protein do not interfere in the cellular UV sensitivity and the DNA repair activity in the global genome. Nevertheless, a higher number of cells in the apoptotic process were detected in short periods of time after UV light when compared to normal cells (HeLa). The adenovirus vector carrying the cDNA xpa (AdyXPA) can efficiently complement XPA patients fibroblast cells. In spite of the short period of the transgene expression and the known imunological reaction caused by adenovirus, this vector represents a potential tool for gene complementation diagnostic and gene correction in XP patients.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-18092001-091424 |
| Date | 19 April 2001 |
| Creators | Muotri, Alysson Renato |
| Contributors | Menck, Carlos Frederico Martins |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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