Doenças da córnea estão entre as principais causas de cegueira e os mecanismos de lesão e reparação estão em grande parte concentradas no epitélio, porém os mediadores e alvos para possíveis intervenções terapêuticas são pouco conhecidos.Nas agressões ao epitélio da córnea, a ativação dos receptores vanilóides de potencial transitório 1 (TRPV1) leva a resposta inflamatória e cicatricial. O objetivo desse trabalho é identificar os mecanismos de sinalização e resposta do TRPV1 na córnea de animais experimentais. O cultivo de células epiteliais de córnea de ratos, a identificação de mediadores por western blot, medida do influxo de cálcio, resposta de citocinas medidas por ensaio quantitativo de PCR em tempo real (RNAm) e ELISA (proteína) após estímulos nocioceptivos ou inflamatórios; e a investigação histológica e imunohistoquimica em modelos animais, sejam ratos com diabetes mellitus (DM) por 8 semanas ou expostos a cloreto de benzalcônio a 0,2% (BAC) por 7 dias. Camundongos TRPV1-/- comparados aos controles C57 foram comparados sem estimulo, ou sob estimulo único com CAP a 1µM, BAC 0,2 % por 7 dias ou após queimadura alcalina com NaOH a 1M. Os resultados mostraram a presença de TRPV1 em epitélio de córnea em cultura primária, mostraram que essas células respondem com influxo de cálcio ao estímulo com o agonista Capsaicina a 1µM e aumento de TNF? e IL-1? (sendo máximo nas combinações CAP+CPZ e Win+CAP, respectivamente). Em ratos com DM e BAC ocorre a redução da expressão do RNAm de IL-1? (p=0,0269) na córnea, entre outras alterações. Os camundongos TRPV1-/- tem fenótipo físico e ocular normal, porém reduzida sensibilidade a CAP 1µM. O tratamento com BAC leva a diminuição da secreção lacrimal (p=0,0011) e de IL-1? e TNF? na glândula lacrimal (GL) de TRPV1-/- machos (p=0,0177, p=0,0245, respectivamente). A queimadura alcalina com NaOH 1M resultou em melhor cicatrização e maior espessura epitelial no grupo TRPV1-/-. Em ix conclusão, o TRPV1 está presente na córnea e atua em resposta a agressões externas. Situações adquiridas como DM e toxicidade por BAC, reconhecidas como neuropáticas diminuem a expressão de mediadores inflamatórios. A ausência genética e TRPV1 não altera o fenótipo, mas apresenta menor sensibilidade e melhor restauração da superfície ocular após queimadura alcalina / Corneal diseases are among the leading causes of blindness.Damage and repair mechanisms are largely concentrated in the epithelium, but the mediators and targets for possible therapeutic interventions are poorly understood. The aggressions to the corneal epithelium, the activation of vanilloid receptors transient potential 1 (TRPV1) leads to inflammatory and wound healing. The aim of this study is to identify the signaling mechanisms and TRPV1 response in the cornea of experimental animals.The culture of epithelial cells from rat cornea, to identify mediators by western blot analysis, measurement of calcium influx, cytokine response measured by PCR real time (mRNA) and ELISA (protein) nocioceptivos or after inflammatory stimuli; and the histological and immunohistochemical investigation in animal models are mice with diabetes mellitus (DM) for 8 weeks, and exposed to benzalkonium chloride at 0.2% (BAC) for 7 days. Mice TRPV1-/- compared to control C57 were compared with no stimulus, or under single stimulation with 1 µM Capsaicine (CAP), BAC 0.2% for 7 days or after the alkali burn with NaOH 1 M.The results showed the presence of TRPV1 in corneal epithelium in primary culture, showed that these cells respond to calcium influx the stimulus with capsaicin agonist 1?M and increase of TNF? and IL-1? (being maximum at the CAP + CPZ combinations and Win + CAP, respectively). In rats with DM and BAC occurs reducing the expression of IL-1? mRNA (p = 0.0269) in the cornea, among other changes. The TRPV1-/- mice have physical phenotype and normal ocular but low sensitivity to CAP 1?M. Treatment with BAC leads to decreased tear secretion (p = 0.0011) and IL-1? and TNF? in the lacrimal gland (GL) of TRPV1-/- mice (p = 0.0177, p = 0.0245, respectively) . The alkaline burn with NaOH 1M resulted in better healing and greater epithelial thickness in TRPV1-/- group .In conclusion, TRPV1 is present in the cornea and operates in response to external aggressions. Situations existing as DM and xi toxicity BAC recognized as neuropathic decrease the expression of inflammatory mediators. Genetic absence and TRPV1 does not alter the phenotype, but has lower sensitivity and better restoration of the ocular surface after alkaline burn
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-19072016-171535 |
| Date | 13 November 2015 |
| Creators | Dias, Lara Cristina |
| Contributors | Rocha, Eduardo Melani |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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