Following infection by most viruses, an antiviral state is induced in the host cells characterized by the expression of interferon (IFN) and several IFN-stimulated genes (ISGs). IFN treatment is effective to inhibit HIV replication in infected cells, but shows no significant improvement of HIV-infected patients. Currently, the discrepancy between the in vitro and the in vivo findings remains largely unresolved. The IFN-induced RNA-dependent protein kinase PKR is activated via trans-phosphorylation and plays a central role in the IFN-induced antiviral pathway. Our results show that PKR is transiently activated following HIV-1 infection of Jurkat and peripheral blood mononuclear cells. The kinase is then inactivated at the viral peak, when HIV replication is highly active. By immunoprecipitation, we found that PKR forms a ribonucleoprotein complex with cellular double-stranded RNA binding proteins (dsRBPs), the TAR RNA Binding Protein (TRBP), the adenosine deaminase acting on RNA (ADAR)1 and the PKR Activator (PACT) during HIV replication. Over-expression of PKR is sufficient to inhibit HIV production in HEK 293T cells. This inhibition is reversed by expression of the ADAR1, another ISG. By using mutants of ADAR1, we show that this activity is linked to the ability of the protein to bind PKR. In astrocytes that do not replicate HIV efficiently due to an enhanced PKR response, ADAR1 partially restores viral expression. Surprisingly, PACT binds to and inhibits PKR activity. All three dsRBPs, TRBP, ADAR1 and PACT prevent PKR activation and the phosphorylation of its downstream target, eIF2alpha. Together, our results highlight the key function of PKR in innate immunity and its multiple-level of regulation during HIV-1 replication. / L'infection d'une cellule par un virus induit un état antiviral, caractérisé par l'expression de l'interféron (IFN) et de plusieurs gènes induits par l'IFN. Le traitement par l'IFN est efficace pour inhiber la réplication du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) dans des cellules infectées en culture, mais ne montre aucun effet bénéfique chez les patients infectés par ce même virus. Cette disparité qui existe entre les résultats de recherche in vivo et in vitro n'est toujours pas résolue. PKR, une protéine kinase induite par les IFNs, est activée par phosphorylation et joue un rôle central dans le mécanisme antiviral de l'IFN. Nos résultats démontrent que PKR est activée de manière transitoire suite à l'infection de cellules lymphocytaires Jurkat ou de lymphocytes/monocytes primaires du sang périphérique par le VIH. Par contre, la kinase n'est plus activée durant et après le pic d'infection, lorsque la réplication du virus est intense. Par immunoprécipitation, nous avons démontré que PKR forme un complexe ribonucleoprotéique avec plusieurs protéines cellulaires qui lient l'ARN double-brin, soit la protéine liant l'ARN TAR, TRBP, l'adénosine déaminase ADAR, ainsi que la protéine activatrice de PKR, PACT, pendant la réplication virale. La surexpression de PKR est suffisante pour inhiber la production du VIH dans les cellules HEK 293T. Cette inhibition est supprimée par l'expression d'ADAR1, une des protéines induite par les IFNs. Par différentes mutations dans la séquence protéique d'ADAR1, nous avons démontré que cette activité d'ADAR est liée à sa capacité de lier PKR. Dans les astrocytes, qui ne répliquent pas le VIH efficacement en raison d'une activation accrue de PKR, ADAR1 rétablit partiellement l'expression virale. Étonnamment, PACT se lie à PKR et inhibe son activité dans les cellules infectées par le VIH. Testées en parallèle, TRBP, ADAR1 et PACT empêchent l'activation de PKR ainsi que la phos
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.92289 |
| Date | January 2010 |
| Creators | Clerzius, Guerline |
| Contributors | Anne Gatignol (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Medicine) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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