Viruses are obligate intracellular parasites. Most possess small genomes with a limited coding capacity, which means that they rely on host factors for the completion of their life cycle. The recruitment of cellular proteins is essential as in their absence viruses cannot replicate effectively. Tandem affinity purification was used in Arabidopsis thaliana to identify host interactors of Turnip mosaic virus (TuMV) RNA-dependent RNA polymerase (RdRp). The heat shock cognate 70-3 (Hsc70-3) and poly(A)-binding (PABP) proteins were recovered and shown to interact with the RdRp in vitro. As previously shown for PABP, Hsc70 was redistributed to nuclear and membranous fractions from infected plants and both RdRp interactors were co-immunoprecipitated from a membrane-enriched extract using RdRp specific antibodies. Fluorescently-tagged RdRp and Hsc70-3 localized to cytoplasm and nucleus when expressed alone or in combination in Nicotiana benthamiana. However, when co-expressed with TuMV membrane binding protein 6K-VPg-Pro, they were redistributed to large perinuclear vesicles where replication takes place. Thus, Hsc70-3 and PABP2 are potentially integral components of the replicase complex and could have important roles to play in potyviral RdRp functions. To further characterize the role of PABP in potyvirus infection single and double gene knockouts were isolated and characterized for all high expressing class II PABP genes in Arabidopsis thaliana: PAB2, PAB4 and PAB8, all of which were found to be viable and fertile. Whereas single knockout plants, for the most part, demonstrate a normal phenotype, pab2 pab4 and pab2 pab8 double mutants had important debilitations in regard to the growth and development of both vegetative and reproductive organs. Experiments with these PABP deficient plants indicate that partial PABP depletion in A. thaliana, although not sufficient to confer complete resistance, can impede replicative cycle of TuMV in the cell. TuMV replication in the / Les virus sont des parasites intracellulaires stricts. La plupart possèdent de petits génomes ayant une capacité d'encodage limitée et dépendent conséquemment des facteurs de l'hôte pour compléter leur cycle d'infection. Le recrutement de ces protéines est essentiel à leur réplication. Nous avons utilisé une stratégie de purification en tandem dans Arabidopsis thaliana dans le but d'identifier les protéines de l'hôte interagissant avec la polymérase virale à ARN (RdRp) du virus de la mosaïque du navet (TuMV). Les protéines Hsc70-3 et PABP ont été purifiées et leur interaction avec la RdRp confirmée in vitro. Tel que rapporté pour la PABP, la Hsc70 s'est retrouvée redistribuée aux fractions nucléaires et membranaires dans des plants infectés. De plus, nous avons été en mesure de co-immunoprécipiter ces deux protéines dans un extrait membranaire avec un anticorps anti-RdRp. Lorsqu'exprimées seules ou ensemble dans Nicotiana benthamiana, la RdRp et la Hsc70-3 localisèrent au cytoplasme et au noyau. Par contre, lorsque co-exprimées avec le polypeptide 6K-VPg-Pro du TuMV, elles se trouvèrent redistribuées à l'intérieur d'une vésicule périnucléaire là où le virus se réplique. Hsc70-3 et PABP2 sont donc potentiellement des protéines faisant partie du complexe de réplication et ont probablement un rôle important à jouer dans les fonctions de la RdRp. Afin de déterminer le rôle de la PABP dans le cycle de réplication des potyvirus, nous avons généré des mutants d'A. thaliana knockout simple ou double pour tous les gènes de PABP de la classe II; PAB2, PAB4 et PAB8. Alors que les mutants simples présentent un phénotype normal, les mutants double pab2 pab4 et pab2 pab8 ont des déficiences de croissance et de développement. Les expériences menées avec ces plants indiquent qu'une déplétion partielle des niveaux de PABP, quoique étant insuffisante pour mener à un phénotype de résistance complet, inhibe le cycle
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.21945 |
| Date | January 2008 |
| Creators | Dufresne, Philippe |
| Contributors | Marc Fortin (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Plant Science) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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