Human Immunodeficiency Virus type 1 (HIV-1) is a member of the Retrovirus family and is the causative agent of Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS). As an obligate intracellular parasite, HIV-1 uses cellular proteins and machinery to ensure transmission to uninfected cells. One such cellular protein involved in the late stages of viral replication is Staufen1. It is a main component of mRNA ribonucleoproteins (RNPs) and plays distinct roles in mRNA transport, translation and decay. In the context of HIV-1, Staufen1 was initially found to be selectively encapsidated into the virions. Subsequent work determined its association with vRNA and precursor protein Gag within HIV-1 RNPs. Recently we demonstrated that Staufen1 regulates the viral assembly process by inducing Gag multimerization.In Chapter 2 of the present work, we used tandem affinity purification method followed by mass spectrometry to characterize the Staufen1-containing RNPs. We focused on the investigation of the proteins that associate with Staufen1 complexes, isolated from cells that either do or do not express HIV-1. We further performed a detailed comparison of the protein content between native Staufen1 and Staufen1 HIV-1 RNPs and defined the modulations caused from HIV-1 expression. In Chapter 3, we used bimolecular and trimolecular fluorescence complementation methods (BiFC and TriFC) that allow for direct visualization and localization of protein-protein and protein-protein and RNA interactions in living cells, to show that Gag and Staufen1 interact, which was demonstrated by small multi-fluorescent punctae or vesicles in cells. We demonstrated that these protein partners mainly associate in the cytoplasm. However, we also found that they interact at cholesterol-enriched GM-1-containing membrane microdomains. Importantly, Gag specifically recruited Staufen1 to these lipid raft membranes suggesting a key function for this host factor during Gag assembly. Notably in TriFC experiments, in which one protein partner was tethered to mRNA, Gag-Staufen1 interactions were observed demonstrating active recruitment of one protein when the other is bound to mRNA.Overall, we used both proteomics and live cell visualization to examine fundamental viral-host interactions. We have completely characterized the composition of Staufen1 RNPs and have demonstrated how HIV-1 uses these RNPs for its own purpose. These studies also enhance our understanding of the mechanisms and the specific dynamic features of the viral-host (Gag-Staufen1) interactions in living cells, as monitored by the modern fluorescence complementation assays. The findings presented here are significant help to advance research in the HIV-1 field because a better understanding of the mechanism of retrovirus assembly and budding will aid in the development of novel antiviral therapies targeting the critical late steps in the viral replication cycle. / Le virus d'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est un membre de la famille de Rétrovirus et est responsable du syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA). Considéré comme un parasite intracellulaire obligatoire, le VIH-1 utilise les protéines et les machineries cellulaires pour assurer la transmission aux cellules non infectées. Un des facteurs impliqués dans les étapes finales de réplication virale est la protéine Staufen1. Cette protéine est un composant important des ARNm ribonucléoprotéiques et joue des rôles clés dans le transport, la traduction et la dégradation de l'ARNm. Concernant le VIH-1, Staufen1 a été initialement découvert comme étant spécifiquement encapsidé dans les virions. Des travaux plus approfondis ont déterminé son association avec l'ARNv et le précurseur Gag dans les VIH-1 RNPs. Récemment, nous avons démontré que Staufen1 régule le processus d'assemblage viral en induisant le multimérisation de Gag.Dans le travail présent, nous avons employé la méthode de purification d'affinité en tandem suivie de la spectrométrie de masse pour caractériser les RNPs contenus dans Staufen1. Nous nous sommes concentrés sur la recherche des protéines qui s'associent aux complexes Staufen1 isolés des cellules qui expriment ou non VIH-1. Ensuite, nous avons effectué une comparaison détaillée du contenu protéique entre Staufen1 sous forme native et Staufen1 complexé au RNPs VIH-1 et nous avons défini les modulations causées par l'expression de VIH-1.Nous avons utilisé les méthodes de complémentation par fluorescence bimoléculaire et trimoleculaire qui permettent la visualisation et la localisation directes des interactions protéine-protéine et des interactions protéine-protéine et d'ARN dans des cellules vivantes, pour prouver que Gag et Staufen1 interagissent comme démontré par la fluorescence ponctuée ou les vésicules dans les cellules. Nous avons démontré que les protéines partenaires s'associent principalement dans le cytoplasme. Cependant, nous avons également constaté qu'ils interagissent dans des microdomaines membranaires contenant du cholestérol enrichis en GM-1. De manière importante, Gag recrute spécifiquement Staufen1 au niveau de ces membranes de radeaux lipidiques, suggérant une fonction essentielle de ce facteur d'hôte pendant l'assemblage de Gag. En particulier, des expériences de TriFC dans lesquelles une protéine partenaire est attachée à l'ARNm ont permis de montrer des interactions Gag-Staufen1 indiquant un recrutement actif des protéines lorsqu'elles sont attachées à l'ARNm.De façon générale, les travaux présentent des recherches de protéomique fondamentale et de visualisation de cellules vivantes d'interaction virus-hôte. Ces expériences présentent la caractérisation complète de la composition de Staufen1 RNPs et démontre comment le VIH-1 s'adapte pour ses propres besoins. Cette thèse s'enrichit également de notre compréhension des mécanismes et des caractéristiques dynamiques spécifiques des interactions virus- hôte (Gag-Staufen1) dans des cellules vivantes, contrôlées par des techniques récentes de complémentation de fluorescence. Les résultats présentés ici sont considérables et contribuent à l'avancée des recherches dans le domaine du VIH-1, parce qu'une meilleure compréhension du mécanisme de l'ensemblage et du bourgeonnement du rétrovirus augmente la possibilité de développer de nouvelles thérapies antivirales, visant les étapes tardives critiques du cycle viral de réplication.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.96998 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Milev, Miroslav |
| Contributors | Andrew J Mouland (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Medicine) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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