The Hepatitis C Virus (HCV) is a major public health concern considering it infects around 3% of the global population and there is currently no virus-specific therapy or vaccine. Several virally-encoded proteins have been identified as potential targets for inhibitor design including the helicase-containing nonstructural protein three (NS3). / Helicases are enzymes that are responsible for the separation of double-stranded nucleic acids prior to most processes of nucleic acid metabolism. It is well documented that disabling the HCV helicase through mutation results in the arrest of the viral lifecycle. The aim of our work was to characterize the details of the molecular biology of the HCV helicase. / We have cloned the helicase domain of NS3 and have conducted studies on its NTPase, DNA binding, and unwinding activities using a collection of biochemical assays. We were able to describe the previously unknown interface that exists between the helicase and a DNA substrate and identify a basic amino acids cluster (K360-K380) that is important for DNA binding and unwinding. We have shown that the previously uncharacterized Motif IV is responsible for binding at the junction between substrate and product DNA. Furthermore, we have implicated residues within Subdomain 3 (K583-K589) that are likely involved in the strand separation process. / Helicases catalyze the separation of nucleic acid strands using the energy that is derived from the hydrolysis of nucleotide triphosphates (NTPs). This chemical reaction powers conformational changes within the protein, resulting in translocation of the helicase along DNA and RNA substrates to eliminate structural features that shield the genetic code. During the second phase of our study, we used a high-resolution protein footprinting assay, among other biochemical tests, to study the link between NTP hydrolysis and the strand separation process. We found that the dynamic movement of Subdomain 2, which contains both Motif IV (in contact with the DNA) and Motif VI (in contact with the NTP) is responsible for transducing NTP hydrolysis energy into the DNA unwinding activity of HCV NS3. / Tenant compte du fait que le virus de l'hépatite C (HCV) infecte approximativement 3% de la population mondiale et qu'il n'existe ni médicament spécifique ni vaccin pour ce virus, celui-ci représente une inquiétude majeure en santé publique. Plusieurs protéines virales ont été identifiées comme sources possibles pour la création d'agents inhibiteurs, incluant la protéine non-structurale 3 (NS3) qui comprend l'activité de l'hélicase. / Les hélicases sont les enzymes responsables de la séparation des deux brins des acides nucléiques qui précède la plupart des processus métaboliques de ceux-ci. La désactivation par mutation de l'hélicase du HCV provoquant l'arrêt du cycle viral est bien documentée. Le but de notre travail était de caractériser les détails de la biologie moléculaire de l'hélicase du HCV. / Nous avons cloné le domaine de l'hélicase de la NS3. Utilisant une multitude d'analyses biochimiques, nous avons étudié son activité NTPase, ainsi que ses activités de fixation et de déroulement d'ADN. Nous avons pu décrire l'interface jusqu'ici inconnue qui existe entre l'hélicase et un substrat d'ADN, et identifier une grappe d'aminoacides (K360-K380) impliqués dans la fixation et le déroulement d'ADN. Nous avons démontré que le Motif IV est responsable de la fixation à la jonction entre le substrat et le produit d'ADN. Nous avons également identifié des résidus du Sous-domaine 3 (K583-K589) qui semblent très probablement impliqués dans le processus de séparation des brins. / L'hélicase catalyse la séparation des brins des acides nucléiques en utilisant l'énergie dérivée de l'hydrolyse de nucléotides triphosphates (NTP). Cette réaction chimique fournit l'énergie nécessaire aux changements conformationnels de la protéine, responsables du mouvement de l'hélicase le long des substrats d'ADN et d'ARN qui élimine les structures masquant le code génétique. Dans la deuxième étape de notre recherche, nous avons utilisé, parmi d'autres tests biochimiques, une méthode d'analyse d'emprunte protéique à haute résolution pour étudier la relation entre l'hydrolyse des NTPs et la séparation des brins des acides nucléiques. Nous avons découvert que le mouvement dynamique du Sous-domaine 2, qui contient à la fois Motif IV (en contact avec l'ADN) et Motif VI (en contact avec le NTP), est responsable de la transduction de l'énergie produite par l'hydrolyse des NTPs en l'énergie nécessaire pour le déroulement d'ADN du HCV NS3.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.86639 |
| Date | January 2010 |
| Creators | Barry, Francois |
| Contributors | Matthias Gotte (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Microbiology and Immunology) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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