L’apoptose, mort cellulaire observée suite à l’activation des caspases effectrices, est un moyen de défense contre les pathogènes, en particulier les virus. Le virus de la vaccine (VACV) est un virus contenant un grand génome à ADN codant pour environ 200 protéines, dont plusieurs inhibent l’apoptose. Cette apparente redondance fonctionnelle complique l’étude des protéines antiapoptotiques du virus dans un contexte d’infection virale. Dans ce travail, nous comparerons les propriétés antiapoptotiques des protéines B13, F1, GAAP et N1 de VACV. Cette comparaison sera établie dans un premier temps en dehors de toute infection virale. En utilisant des vecteurs lentiviraux, nous avons obtenu des lignées cellulaires stables (U2-OS) exprimant ces protéines en isolation. Nous avons alors pu tester les capacités antiapoptotiques de ces protéines en réponse à des stimuli provoquant l’apoptose extrinsèque et intrinsèque. Les résultats ont montré que B13 était la plus puissante molécule inhibitrice de l’apoptose intrinsèque et qu’elle était la seule à inhiber l’apoptose extrinsèque. Ensuite nous avons tiré avantage d’un virus de la vaccine déficient (vv811) qui ne possède aucune de ces protéines antiapoptotiques, capable à lui seul d’induire l’apoptose, en l’absence de toute autre stimulus. En infectant nos lignées cellulaires exprimant les molécules in trans avec vv811, nous avons pu montrer que B13 inhibait cette apoptose induite par le virus beaucoup plus efficacement que F1. GAAP et N1 dans ce contexte n’ont pas démontré de propriétés antiapoptotiques. Enfin, nous avons construit par mutagénèse des virus vv811 recombinants exprimant les molécules étudiées in cis. Suite à l’infection par ces virus de cellules U2-OS et Hela, B13, de nouveau, et F1 ont montré des capacités d’inhibition importantes de l’apoptose. L’action de GAAP s’est révélée dépendante du type cellulaire et N1 n’a pas pu inhiber l’apoptose induite par ce virus déficient dans aucune des cellules testées. En utilisant ces différentes approches, nous avons pu nous affranchir des problèmes de redondance et comparer 4 molécules antiapoptotiques du virus de la vaccine, y compris dans un contexte d’infection virale. Les résultats ont confirmé que toutes les protéines étudiées possédaient des propriétés antiapoptiques et ont clairement montré que B13 était la plus puissante / Apoptosis, which occurs following activation of effector caspases, can restrict the replication of intracellular pathogens, especially viruses. Vaccinia virus (VACV) is a large dsDNA virus encoding approximately 200 proteins, several of which inhibit apoptosis. This redundancy of viral anti-apoptotic proteins complicates the study of these proteins in the context of viral infection. Here a comparative study of the anti-apoptotic proteins B13, F1, GAAP and N1 with and without virus infection is presented. Firstly, using lentiviral constructs, we generated transduced cell lines expressing the anti-apoptotic proteins in isolation and we analysed their ability to protect against extrinsic and intrinsic apoptosis induced by different drugs. In that context B13 was the most potent inhibitor of intrinsic apoptosis and the only protein to inhibit both extrinsic and intrinsic apoptosis. We then used a deficient VACV strain, vv811, that lacks the genes coding for the four anti-apoptotic proteins. Infection with vv811 can induce apoptosis without the need for any other stimulus. After vv811 infection of cell lines expressing the anti-apoptotic proteins in trans, B13 and to a lesser extent F1, inhibited apoptosis. Finally, we introduced each gene separately into vv811 by genetic recombination. Using these recombinant viruses to induce apoptosis, B13 and F1 were very potent inhibitors. The protection conferred by GAAP was cell type dependant and N1 failed to protect any of the tested cells from the virus induced apoptosis. Using these different approaches, we have been able to overcome the redundancy issue to compare 4 anti-apoptotic proteins from VACV, including in the context of viral infection. The results illustrate that vv811 is a useful tool to determine the role of VACV anti-apoptotic proteins during infection and that whilst all of these proteins have some anti-apoptotic activity, B13 is most potent.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2014REN1B015 |
| Date | 05 December 2014 |
| Creators | Veyer, David |
| Contributors | Rennes 1, Colimon, Ronald |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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