The exhaustion of oil fields together with the undesirable effects of its use has turned sugarcane into an attractive crop for the biofuel market, increasing its economic and environmental importance. The position of Brazil as the world\'s major sugarcane producer and the need to expand the planted area to soil with less favorable conditions makes the study of drought, one of the abiotic stresses affecting the most of this crop yield, essential for the future of Brazil as the main exporter of this commodity. This work has the aim of providing a comprehensive analysis of sugarcane drought responses in the physiological and molecular levels. In order to do that we followed four strategies. First, we performed the analysis of physiology and transcriptome (microarray) of drought stressed sugarcane plants in three time points (4 days of stress, 6 days of stress and re-watering) of a greenhouse experiment. The plant material analyzed was leaves and roots. Second, aiming to identify different genes and new patterns of expression it was done the analysis of RNA-Seq from the most discrepant condition, from both leaves and roots, found by the microarray, third, we performed the analysis of a drought progression experiment through physiology and qRT-PCR of selected candidate genes and forth we built co-expression networks to detect interesting patterns. Physiology analysis showed that plants were under moderate to severe water stress with decreases of up to 97% in photosynthesis. Microarray data indentified 7,867 unique SAS with a fold change of more than 2 or less that 0.5, and 575 unique SAS differentially expressed. The analysis of the identified sequences allowed the observation that in leaves after 4 days of stress, the plant is mostly transducing the signal from the environment, while after 6 days and after rehydration there is a more functional response of the plant, with re-watering leading the metabolism back to homeostase. In the case of roots, it was observed a similar response, however roots take longer to go back to the initial condition, since several genes are still being down-regulated even after re-watering. There are also pathways presenting an opposite pattern in the analyzed tissues, being activated in one tissue but repressed in the other, such as Phenylpropanoid Biosynthesis pathway. Furthermore, while in leaves there is a restriction on photosynthesis, on roots it seems to be a restriction on growth. RNA-Seq de novo assembly showed 28,240 differentially expressed features in leaves and 7,435 in roots, while using the reference genome (unpublished data) it was possible to identify 38,317 differentially expressed genes in leaves and 7,649 in roots, and the analysis of KEGG pathways indicate that ABA has a major role in both leaves and roots responses to drought, but in leaves there is an interplay of phytohormones. Drought progression experiment confirms the results obtained from microarray and shows that when stress is extreme, gene expression starts to decrease, suggesting the plant might be entering in senescence. Co-expression analysis allowed the determination of three modules correlated with physiological parameters altered during water stress, and lead to the identification of some possible hub genes that may be important for sugarcane responses to drought. Furthermore, it was possible to identify genes that through both co-expression and qRT-PCR analysis had similar patterns of expression. Altogether, these results give us a comprehensive view of the alterations in sugarcane responses to water stress and helped us gain insight for defining better suited candidate genes for plant breeding. / A exaustão dos combustíveis fósseis juntamente com os efeitos não desejáveis de seu uso, tonaram a cana-de-açúcar uma cultura atrativa para o mercado de biocombustíveis, aumentando a sua importância econômica e ambiental. A posição do Brasil como o principal produtor de cana-de-açúcar e a necessidade de expandir a área plantada para regiões com condições menos favoráveis, tornam o estudo da seca, um dos principais estresses abióticos que afetam a produtividade da cultura, essencial para o futuro do Brasil como o principal exportador dessa comoditie. Este trabalho tem o objetivo de fornecer uma análise global das respostas da cana-de-açúcar à seca, tanto em nível fisiológico quanto molecular. Para isso, foram seguidas quatro estratégias. Primeiro foi realizada uma análise da fisiologia e do transcriptoma (microarranjo) de plantas de cana-de-açúcar cultivadas em casa de vegetação e estressadas por três períodos diferentes (4 dias de estresse, 6 dias de estresse e reidratação). Os tecidos analisados foram folha e raiz. Segundo, com o objetivo de identificar diferentes genes e novos padrões de expressão, foi realizada a análise de RNA-Seq em tecidos de folha e raiz utilizando a condição mais discrepante identificada pelo microarray; terceiro, foi feita a análise de um experimento de progressão da seca por meio da fisiologia e qRT-PCR usando genes candidatos selecionados. A quarta estratégia foi a construção de redes de co-expressão objetivando detectar módulos de genes relacionados à resposta a seca. As análises de fisiologia mostraram que as plantas estavam sob estresse moderado a severo com diminuição de até 97% na fotossíntese. Os dados de microarray levaram à identificação de 7.867 SAS únicos com diferença de razão de expressão maior que 2 ou menor que 0,5, e 575 SAS únicos diferencialmente expressos. A análise das sequencias identificadas permitiu a observação de que em folhas, depois de 4 dias de estresse, há basicamente a transdução dos sinais obtidos a partir do ambiente, enquanto depois de 6 dias e após a reidratação há uma resposta mais funcional da planta, com a última conduzindo o metabolismo de volta à homeostase. No caso das raízes foi observado uma resposta similar, porém, as raízes demoram mais tempo para voltar à condição inicial, de forma diversos genes continuam reprimidos mesmo após a reidratação. Há ainda rotas metabólicas, como o Biosíntese de Fenilpropanoides, que apresentam perfis opostos nos tecidos analisados, sendo ativada em um e reprimida no outro. Além disso, enquanto em folhas há uma restrição na fotossíntese, em raízes parece existir uma restrição no crescimento. A análise de novo do RNA-Seq mostrou 28.240 \"features\" diferencialmente expressos em folhas e 7.435 em raízes, enquanto a utilização do genoma de referência (dados não publicados) identificou 38.317 genes diferencialmente expressos em folha e 7.649 em raiz, sendo que a análise das rotas do KEGG indicam que o ABA tem um papel principal nas respostas à seca em ambos os tecidos, no entanto em folhas existe uma interação entre fitohormônios. O experimento de progressão da seca confirma os resultados obtidos a partir do microarranjo e mostram que quando o estresse é severo, a expressão gênica começa à diminuir, sugerindo que a planta pode estar entrando em senescência. As análises de coexpressão permitiram a determinação de três módulos correlacionados com parâmetros de fisiologia alterados durante o estresse hídrico, e conduziram à identificação de alguns genes centrais que podem ser importantes para as respostas da cana à seca. Além disso, foi possível identificar genes que tanto pela análise de co-expressão quanto pelo qRT-PCR apresentam padrões similar de expressão. Juntos, esses resultados forneceram uma visão global das alterações que ocorrem na cana-de-açúcar em resposta ao estresse hídrico e ajudaram a obter conhecimento para seleção de genes candidatos adequados para o melhoramento genético de plantas.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-22032018-162827 |
| Date | 15 December 2017 |
| Creators | Silva, Danielle Izilda Rodrigues da |
| Contributors | Souza, Glaucia Mendes |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | English |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Reter o conteúdo por motivos de patente, publicação e/ou direitos autoriais. |
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