Pectic polysaccharides, a class of plant cell wall polymers, form one of the most complex networks known in nature. Despite their complex structure and their importance in plant biology, little is known about the molecular mechanism of their biosynthesis, modification, and turnover, particularly their structure-function relationship.
One way to gain insight into pectin metabolism is the identification of mutants with an altered pectin structure. Those were obtained by a recently developed pectinase-based genetic screen. Arabidopsis thaliana seedlings grown in liquid medium containing pectinase solutions exhibited particular phenotypes: they were dwarfed and slightly chlorotic. However, when genetically different A. thaliana seed populations (random T-DNA insertional populations as well as EMS-mutagenized populations and natural variations) were subjected to this treatment, individuals were identified that exhibit a different visible phenotype compared to wild type or other ecotypes and may thus contain a different pectin structure (pec-mutants).
After confirming that the altered phenotype occurs only when the pectinase is present, the EMS mutants were subjected to a detailed cell wall analysis with particular emphasis on pectins. This suite of mutants identified in this study is a valuable resource for further analysis on how the pectin network is regulated, synthesized and modified.
Flanking sequences of some of the T-DNA lines have pointed toward several interesting genes, one of which is PEC100. This gene encodes a putative sugar transporter gene, which, based on our data, is implicated in rhamnogalacturonan-I synthesis. The subcellular localization of PEC100 was studied by GFP fusion and this protein was found to be localized to the Golgi apparatus, the organelle where pectin biosynthesis occurs.
Arabidopsis ecotype C24 was identified as a susceptible one when grown with pectinases in liquid culture and had a different oligogalacturonide mass profile when compared to ecotype Col-0. Pectic oligosaccharides have been postulated to be signal molecules involved in plant pathogen defense mechanisms. Indeed, C24 showed elevated accumulation of reactive oxygen species upon pectinase elicitation and had altered response to the pathogen Alternaria brassicicola in comparison to Col-0. Using a recombinant inbred line population three major QTLs were identified to be responsible for the susceptibility of C24 to pectinases.
In a reverse genetic approach members of the qua2 (putative pectin methyltransferase) family were tested for potential target genes that affect pectin methyl-esterification. The list of these genes was determined by in silico study of the pattern of expression and co-expression of all 34 members of this family resulting in 6 candidate genes. For only for one of the 6 analyzed genes a difference in the oligogalacturonide mass profile was observed in the corresponding knock-out lines, confirming the hypothesis that the methyl-esterification pattern of pectin is fine tuned by members of this gene family.
This study of pectic polysaccharides through forward and reverse genetic screens gave new insight into how pectin structure is regulated and modified, and how these modifications could influence pectin mediated signalling and pathogenicity. / Pektin Polysaccharide, eine Klasse pflanzlicher Zellwand Polymere, formen eine der komplexesten natürlichen Strukturen. Trotz seiner immensen Bedeutung in der Biologie der Pflanzen sind die Kenntisse über die molekularen Mechanismen der Pektin Biosynthese, dessen Modifikation und Abbau überraschend gering.
Eine Möglichkeit neue Einblicke in den pflanzlichen Pektin Metabolismus zu erhalten, ist die Identifizierung von Mutanten mit veränderter Pektinstruktur. Solche Mutanten konnten durch ein neuatiges Selektionsverfahren gefunden werden. Zieht man Keimlinge der Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana) in Flüssigmedium mit Pektinase an, so lässt sich ein typischer Phänotyp beobachten: Die Pflanzen sind kleinwüchsig und leicht chlorotisch. Diesem Verfahren wurden Populationen verschiedener Genotypen (Insertions Linien, EMS Mutanten, natürlich vorkommende Varianten) ausgesetzt. Auf diese Weise wurden Individuen identifiziert, die gegenüber der Pektinase Behandlung eine verminderte oder erhöhte Resistenz aufweisen, was auf eine veränderte Pektinstruktur hindeutet.
Die EMS Mutanten wurden einer detaillierten Zellwand Analyse unterzogen. die so in dieser Arbeit identifizierte Kollektion von Mutanten stellt eine wertvolle Ressource für weitere Forschungsansätze zur Regulation, Biosynthese und Modifikation des Pektins dar.
Die Lokalisation der Insertionen in den T-DNA Linien führte zur Identifikation interessanter Gene, zu denen der putative Zuckertransporter PEC100 gehört. Dieses Gen steht vermutlich in Verbindung mit der Synthese von Rhamnogalakturonan-I, einem Bestandteil des Pektins. In dieser Arbeit konnte PEC100 im Golgi Apparat, dem Ort der Pektin Biosynthese, lokalisiert werden.
Die natürlich vorkommende Variante C24 ist besonders empfindlich gegenüber der Pektinase. Diese Empfindlichkeit konnte anhand rekombinanter Inzucht Linien auf drei bedeutende quantitative Merkmalsloci (QTL) eingegrenzt werden. C24 zeigte zudem ein gegenüber der Referenz verändertes Massenprofil der Oligogalakturonide. Diese werden derzeit als Signalmoleküle in der pflanzlichen Pathogenabwehr diskutiert, was mit der in dieser Arbeit geseigten Resistenz von C24 gegenüber Schwarzfleckigkeit verursachende Pilz (Alternaria brassicicola) korreliert.
In einem revers-genetischen Ansatz wurden zudem Mitglieder der Pektin Methyltransferase Familie als potentielle Enzyme getestet, die die Pektin Methylesterifikation beeinflussen könnten. Diese Mutation in einer dieser Methyltransferasen führte zu Veränderungen des Oligogalakturonid Massenprofils. Dies bestätigt die Hypothese, dass Mitglieder dieser Genfamilie an der Regulation der Methylesterifikation von Pektin beteiligt sind.
Die vorliegende Studie, in der ein genetishen Selektionverfahren und Methoden der reversen Genetik kombiniert wurden, hat neue Einblicke in die Regulation und Modifikation von Pektin geliefert.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:Potsdam/oai:kobv.de-opus-ubp:3525 |
| Date | January 2009 |
| Creators | Nikolovski, Nino |
| Publisher | Universität Potsdam, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät. Institut für Biochemie und Biologie |
| Source Sets | Potsdam University |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | Text.Thesis.Doctoral |
| Format | application/pdf |
| Rights | http://opus.kobv.de/ubp/doku/urheberrecht.php |
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