Les molécules marquées aux isotopes stables, dont on peut assurer la traçabilité biologique grâce aux progrès récents des techniques analytiques, apportent de nouveaux moyens d’investigation du métabolisme. De nouveaux tests de diagnostics cliniques non invasifs sont, à ce jour, de pratique courante (ex. breath test à l’urée 13C). L’intérêt majeur des isotopes stables est évidemment leur innocuité vis-à-vis de l’organisme humain, contrairement aux produits radioactifs. Pour des raisons éthiques bien compréhensibles, l’usage de ces derniers est actuellement proscrit dans les essais in vivo chez l’homme ; dès lors, le développement de méthodes alternatives d’investigations métaboliques ou de diagnostics s’est révélé pertinent.
L’objectif principal de notre étude est la mise au point d’un nouvel outil de suivi du métabolisme thyroïdien basé sur la double dilution de marqueurs isotopiques avec l’emploi de molécules marquées régio-sélectivement au carbone 13 (l’une est la sonde métabolique, la seconde le standard de quantification absolue).
Les étapes développées sont les suivantes :
1.Biosynthèse du précurseur : la L-tyrosine contenant de 1 à 9 carbone 13 ;
2.Synthèse des hormones thyroïdiennes servant de traceurs biologiques ou de standards internes d’analyse (la thyroxine : 13C9 et 13C6-T4 ; la 3,3’,5-triiodothyronine : 13C9-T3) : optimisation de la voie de synthèse de façon à minimiser les pertes en réactifs marqués ;
3.Ingestion ou injection du traceur (13C6-T4) par l’animal ou par l’homme et collecte d’échantillons de plasma sur une période de temps donnée ;
4.Ajout du standard interne au plasma (13C9-T4 ou 13C9-T3) ;
5.Extraction par solvants, purification et dérivation des hormones thyroïdiennes (endogène, exogène et standard) du plasma ;
6.Analyse et quantification par chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (par suivi des ions spécifiques de chaque entité moléculaire).
L’optimisation instrumentale du protocole analytique GC-MS - à savoir la séparation chromatographique et la gestion des ions de masse en mode SIR - a été maîtrisée pour l’analyse de traces de T3 et T4 ; les limites de détection actuelles sont de l’ordre de 20 pg pour chacune des hormones.
Une mise en œuvre de tests in vivo de 13C9-T4 comme traceur métabolique a été réalisée sur animaux sous contrôle vétérinaire avec la collaboration du Département de Biochimie Clinique de la « Royal Infirmary » d’Edinbourg. Ils nous ont permis de démontrer la faisabilité de la méthodologie (incorporation de la sonde et son suivi temporel) et la possibilité d’utiliser ces traceurs comme sondes chez l’homme.
The principal objective of this thesis is the development of a new tool for the study of the thyroid metabolism based on double isotopic dilution technique with the use of two isotopomers of the same hormone enriched with distinct carbon 13 contents (one as metabolic tracer, the second as internal standard).
The successive stages of the methodology are described below:
1.Biosynthesis of the starting material (L-tyrosine) enriched with 1 to 9 carbon 13;
2.Optimized synthesis of the thyroid hormones being used as biological tracers or analytical internal standards (thyroxine : 13C9 and 13C6-T4; 3,3',5-triiodothyronine : 13C9-T3);
3.Incorporation of the tracer (13C6-T4) by the patient and collect of samples of plasma over a given period of time;
4.Internal standard addition to plasma (13C9-T4 or 13C9-T3);
5.Solvent extraction, purification of the thyroid hormones (endogenous, tracer and standard) of the plasma; and derivatization of the thyroid hormones;
6.Analysis and quantification by gas chromatography coupled with mass spectrometry (by follow-up of the specific ions of each isotopomer), monitoring of (m/z) values 970/979 and 976/979 for thyroxine.
The instrumental optimization of GC-MS analytical protocol - namely chromatographic separation and management of the ions of mass in SIR mode - was worked out for the analysis of traces of T3 and T4. The limit of detection is 20 pg for each molecule.
A first implementation in in vivo tests of 13C9-T4 as a metabolic tracer was carried out under veterinary control on cats and rabbits thanks to the collaboration of the Clinical Department of Biochemistry of Royal Infirmary of Edinburgh. They enabled us to prove the feasibility of the methodology (incorporation of the probe and its temporal follow-up) and the possibility of using these tracers as probes for human beings.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:BICfB/oai:fpms.ac.be:ETDFPMS:FPMSetd-10152004-141558 |
| Date | 15 December 2003 |
| Creators | Hantson, Anne-Lise |
| Contributors | Bille, Vincent, Decroly, André, Hanton, Jean, Michel, Alain, Thienpont, Linda, Vanderpas, Jean, Petitjean, Jean-Pierre, De Meyer, Michel |
| Publisher | Faculte Polytechnique de Mons |
| Source Sets | Bibliothèque interuniversitaire de la Communauté française de Belgique |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | text |
| Format | application/pdf |
| Source | http://theses.fpms.ac.be/ETD-db/collection/available/FPMSetd-10152004-141558/ |
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