Molecular and functional analysis of small molecule binding to protein can provoke insights into cellular signaling and regulatory systems as well as facilitate pharmaceutical drug discovery. In label free small molecule detection the displacement assay format can be applied. This assay format comprises the displacement of receptor molecules bond to immobilized ligand by a competition reaction with ligand in solution. This is beneficial because displacement of high molecular receptors is detected compared to low molecular ligand as in classical binding analysis therefore potentially lowering the method detection limit.
It was hypothesized that with choosing appropriate measuring methods and theoretical modeling reaction rate constants can be determined separately in every kinetic stage of the assay format. Herein elucidating the dominant valence of antibody antigen binding in the established assay was of great importance. Using the Influenza Hemagglutinin (HA) peptid binding to mono or bivalent Anti-Hemagglutinin peptide antibody displacement assay formats could be established. The exact time resolved analysis of binding and dissolution of ligand HA and Anti-Hemagglutinin peptide antibody was achieved with surface plasmon resonance (SPR) spectroscopy.
Mathematical models could be developed from kinetic equations of ligand binding to mono or bivalent antibody. With this, an accurate simulation of the SPR results was reached. The simulation plot had to be exactly adjusted to the SPR results to determine all kinetic rate constants defining ligand and receptor binding kinetics. Large variations in receptor concentration gave almost identical rate constants in binding; this proves the quality of SPR measurements and demonstrates consistence between measurement, simulation, and binding model. Maximum decline of SPR response could be used to determine ligand concentrations in analyte. Displacement dependence from antigen concentration was found to be exponential and was explained by rebinding.
Kinetic data and models could be transferred for the simulation of almost stationary displacement assay formats realized with impedance and fluorescence spectroscopy. With the obtained results it was possible to detect the displacement of the bacterial signaling autoinducer AI-2 by a displacement assay format using periplasmic binding protein LuxP as receptor. Concluding it can be said that the hypothesis could be proved and the obtained results can facilitate the use of displacement assay formats in biosensing. Displacement assay formats should be especially interesting in small molecule detection and in compact integrated mass sensitive sensor designs suitable as mobile sensors in outdoor screening.:Zusammenfassung i
Summery iii
Inhaltsverzeichnis v
1. Problemstellung 1
2. Kinetisches Modell für Displacement-Assays mit monovalenten Antikörpern 5
2.1 Kinetisches Modell 6
2.1.1 Grundgleichungen 6
2.1.2 Analytische Näherungslösung 8
2.1.3 Numerische Lösung 10
2.2 Vergleich mit experimentellen Beispielen 18
2.2.1 Surface-Plasmonen-Resonanzspektroskopie eines Hämagglutinin- Peptid/Hämagglutinin-Antikörper-Displacement-Assays 18
2.2.2 Fluoreszenzspektroskopie eines Hämagglutinin-Peptid/Hämagglutinin-Antikörper-Displacement-Assays 36
2.2.3 Analyse eines LuxP/AI2-Displacementassays mittels SPR-Spektroskopie 52
3. Kinetisches Modell für Displacement-Assays mit bivalenten Antikörpern 70
3.1 Kinetisches Modell 70
3.1.1 Grundgleichungen 70
3.1.2 Numerische Lösung 72
3.2 Vergleich mit experimentellen Beispielen 80
3.2.1 Surface-Plasmonen-Resonanzspektroskopie eines Hämagglutinin- Peptid/Hämagglutinin-Antikörper-Displacement-Assays 80
3.2.2 Impedanzspektroskopie eines Hämagglutinin-Peptid/Hämagglutinin-Antikörper-Displacement-Assays 88
4. Konklusionen und Ausblick 92
5. Anhänge 98
A1: Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie 98
A2: Aufbau der Messschichten und Messreihen eines Hämagglutinin-Peptid/Hämagglutinin-Antikörper-Displacement-Assays 105
A3: Schichtaufbau zur Analyse eines LuxP/AI2-Displacementassays mittels SPR-Spektroskopie 119
A4: Aufbau zur Fluoreszenzspektroskopie eines Hämagglutinin-Peptid/Hämagglutinin-Antikörper-Displacement-Assays 125
A5: Impedanzspektroskopie 128
A6: Transferratenkonstanten 139
A7: Abkürzungsverzeichnis 141
6. Literatur 146
7. Danksagung 155
8. Selbständigkeitserklärung 157 / Die Analyse des Bindungsverhaltens niedermolekularer Liganden an Proteine ist für die Aufklärung von biologischen Regulationssystemen oder bei der Suche neuer medizinischer Wirkstoffe von Wichtigkeit. Ein markierungsfreies Detektions¬prinzip zur Erfassung niedermolekularer Liganden ist die Displacement- oder Replacement-Methode. Bei dieser tritt die Bindung des Rezeptors an den immobilisierten Liganden mit der Bindung an freien Liganden in Konkurrenz, sodass anstelle der niedermolekularen Liganden die hochmolekularen Rezeptoren detektiert werden können.
In dieser Arbeit wurde von der Hypothese ausgegangen, dass durch die Auswahl geeigneter Messverfahren und der zugeordneten Modellierung die einzelnen kinetischen Stadien des Displacements separat zur Bestimmung der kinetischen Konstanten der Displacementprozesse genutzt werden können. Dabei sollte unter anderem auch eine Aussage über die dominierende Valenz der Antigen-Antikörper-Bindung erreicht werden. Hierzu wurden auf der Basis des Modellsystems Hämagglutinin-Peptid/ Hämagglutinin-Antikörper Displacement-Assays mit mono- und bivalenten Anti-körpern entwickelt, anhand derer eine genaue zeitaufgelöste Analyse des Bindungs- und Ablösungsverhaltens vom Liganden HA an den Anti-HA-Antikörper (Rezeptor) mittels Oberflächenplasmonenresonanz(SPR)-Spektroskopie erzielt wurde.
Ausgehend von den Reaktionsgleichungen zwischen Liganden und mono- und bivalenten Rezeptoren wurden mathematische Modelle entwickelt, die eine exakte Simulation der SPR-Ergebnisse ermöglichten. Durch genaues Anpassen der Simulationsplots an die Messplots konnten alle Ratenkonstanten, die die Kinetik der Reaktionen zwischen Liganden, Rezeptoren und ihren Komplexen bestimmen, ermittelt werden. Da auch für eine große Variation der Rezeptorkonzentrationen in der Analytlösung nahezu identische Werte für die Ratenkonstanten erhalten wurden, ergeben Messungen und Simulationen ein konsistentes Bild der Anbindungskinetik und bestätigen die Qualität der Messungen. Aus Messungen des maximalen Responsabfalles kann die Konzentration der freien Antigene beim Displacement ermittelt werden. Man findet eine exponentielle Abhängigkeit des Displacements von der Konzentration der freien Antigene, die sich durch den sogenannten „Rebindingeffekt“ erklären lässt. Die gewonnenen kinetischen Daten und entwickelten Modellierungsverfahren konnten zur Simulation quasistationärer Detektionsverfahren, die mit Fluoreszenz- und Impedanzspektroskopie durchgeführt wurden, erfolgreich angewandt werden.
Die erzielten Erkenntnisse konnten auf ein wissenschaftlich herausforderndes biologisches System (LuxP/AI2) angewandt werden, bei dem das niedermolekulare Signalmolekül AI2 über ein Displacementassay detektiert wurde. Dieses System ermöglicht einen Einblick in die Intra- und Interspezieskommunikation bei Bakterien. Insgesamt zeigt sich, dass die hier formulierte Hypothese als bewiesen angesehen werden kann. Die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse eröffnen verschiedene Einsätze der Displacementmethode in der Biosensorik. Insbesondere lassen sich damit kleine Moleküle markierungsfrei quantitativ bestimmen, ohne hoch präzise Analysengeräte einsetzen zu müssen. Damit ergibt sich die Möglichkeit, sehr kompakte integrierte massensensitive Sensoren, die nicht die Empfindlichkeit hochempfindlicher SPR-Spektrometer erreichen, zur Detektion kleiner Moleküle einzusetzen. Dies ist besonders für mobile Anwendungen von Interesse.:Zusammenfassung i
Summery iii
Inhaltsverzeichnis v
1. Problemstellung 1
2. Kinetisches Modell für Displacement-Assays mit monovalenten Antikörpern 5
2.1 Kinetisches Modell 6
2.1.1 Grundgleichungen 6
2.1.2 Analytische Näherungslösung 8
2.1.3 Numerische Lösung 10
2.2 Vergleich mit experimentellen Beispielen 18
2.2.1 Surface-Plasmonen-Resonanzspektroskopie eines Hämagglutinin- Peptid/Hämagglutinin-Antikörper-Displacement-Assays 18
2.2.2 Fluoreszenzspektroskopie eines Hämagglutinin-Peptid/Hämagglutinin-Antikörper-Displacement-Assays 36
2.2.3 Analyse eines LuxP/AI2-Displacementassays mittels SPR-Spektroskopie 52
3. Kinetisches Modell für Displacement-Assays mit bivalenten Antikörpern 70
3.1 Kinetisches Modell 70
3.1.1 Grundgleichungen 70
3.1.2 Numerische Lösung 72
3.2 Vergleich mit experimentellen Beispielen 80
3.2.1 Surface-Plasmonen-Resonanzspektroskopie eines Hämagglutinin- Peptid/Hämagglutinin-Antikörper-Displacement-Assays 80
3.2.2 Impedanzspektroskopie eines Hämagglutinin-Peptid/Hämagglutinin-Antikörper-Displacement-Assays 88
4. Konklusionen und Ausblick 92
5. Anhänge 98
A1: Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie 98
A2: Aufbau der Messschichten und Messreihen eines Hämagglutinin-Peptid/Hämagglutinin-Antikörper-Displacement-Assays 105
A3: Schichtaufbau zur Analyse eines LuxP/AI2-Displacementassays mittels SPR-Spektroskopie 119
A4: Aufbau zur Fluoreszenzspektroskopie eines Hämagglutinin-Peptid/Hämagglutinin-Antikörper-Displacement-Assays 125
A5: Impedanzspektroskopie 128
A6: Transferratenkonstanten 139
A7: Abkürzungsverzeichnis 141
6. Literatur 146
7. Danksagung 155
8. Selbständigkeitserklärung 157
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:30650 |
| Date | 08 February 2017 |
| Creators | Gelinsky-Wersing, Dagmar |
| Contributors | Pompe, Wolfgang, Wiesmann, Hans-Peter, Technische Universität Dresden |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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