Multicellular life is formed by an orchestrated interplay of processes on different scales in space and time. Observing and quantitatively measuring these processes in an intact, living organism requires gentle and adaptive imaging.
One example of such a process is the scaling of the mitotic spindle during early development. The spindle segregates the chromosomes during cell division and the spindle length determines the positioning of the chromosomes in the successive daughter cells. Thus, adaptation of spindle size to cell size is crucial for proper functioning. Early development is an excellent phase to study spindle scaling since cells rapidly divide in the absence of growth. In this phase, the spindle can be studied in cells of the same organism changing its volume orders of magnitude.
During early zebrafish embryogenesis, the mitotic spindle only appears for three minutes out of the fifteen minutes cell cycle. Quantifying these short-lived events in a living embryo requires flexible and adaptive multi-resolution recordings, which are impossible with any state-of-the-art microscope. In this thesis, I present two new techniques to adaptively image biological samples based on light sheet fluorescence microscopy (LSFM).
First, I present a remote, contact-free positioning technique based on magnetic forces to orient the sample in the microscope. When imaging biological samples, there is often only one sample orientation that offers the best view on the region of interest. This preferred orientation typically changes over time as the specimen grows and develops. The contact-free positioning technique allows to always image specimens from the optimal viewing angle. I demonstrate the functionality of this method by 3D orientation of zebrafish embryos and zebrafish larvae.
Second, I present a new type of LSFM that autonomously adapts its detection scheme to the sample state. This microscope contains an adaptable magnification module to map the development of the millimeter-sized zebrafish embryo and measure single-molecule dynamics of individual spindles in a single experiment. To automatically adapt the detection scheme, I trained a Convolution Neural Network to detect the cell cycle state of individual cells from acquired fluorescence images. Using this new type of LSFM, I demonstrate autonomous measurements of the mitotic spindle scaling in freely developing zebrafish embryos. / Multizelluläres Leben wird durch ein orchestriertes Zusammenspiel von Prozessen auf verschiedenen Skalen in Raum und Zeit gebildet. Beobachtung und quantitative Messungen dieser Vorgänge in einem intakten, lebenden Organismus erfordern schonende und adaptive Bildgebung.
Ein Beispiel für einen solchen Prozess ist die Größenanpassung der mitotischen Spindel während der frühen Entwicklung. Die Spindel trennt die Chromosomen während der Zellteilung und die Spindellänge bestimmt die Positionierung der Chromosomen in den Tochterzellen. Daher ist die Anpassung der Spindelgröße an die Zellgröße entscheidend für die ordnungsgemäße Funktion. Die Phase der frühen Entwicklung eignet sich hervorragend zur Untersuchung der Spindel-Skalierung, da die Zellen sich schnell teilen ohne zu wachsen.
Während der frühen Zebrafischembryogenese erscheint die Spindel nur drei Minuten innerhalb des fünfzehnminütigen Zellzyklus. Die Quantifizierung dieser kurzlebigen Ereignisse in einem lebenden Embryo erfordert flexible und anpassungsfähige Aufnahmen mit variabler Auflösung, die mit keinem Mikroskop nach dem aktuellen Stand der Technik möglich sind. In dieser Arbeit präsentiere ich zwei neue Techniken zur adaptiven Abbildung biologischer Proben basierend auf der Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie (LSFM).
Zuerst stelle ich eine berührungslose Positionierungstechnik vor, die auf Magnetkräften basiert, um die Probe im Mikroskop zu orientieren. Bei der Abbildung biologischer Proben gibt es oft nur eine Probenorientierung, welche die beste Sicht auf die Region von Interesse bietet. Diese Vorzugsorientierung ändert sich typischerweise mit der Zeit, wenn die Probe wächst und sich entwickelt. Die Positionierungstechnik ermöglicht es, Proben immer aus dem optimalen Betrachtungswinkel abzubilden.
Zweitens stelle ich einen neuen Typ von LSFM vor, der sein Detektionsschema autonom an den Probenzustand anpasst. Dieses Mikroskop enthält ein anpassbares Vergrößerungsmodul, um die Entwicklung des millimetergroßen Zebrafischembryos abzubilden und die Einzelmoleküldynamik einzelner Spindeln in einem einzigen Experiment zu messen. Um die Detektion automatisch anzupassen, trainierte ich ein Convolutional Neural Network, um den Zellzyklusstatus einzelner Zellen anhand der aufgenommenen Fluoreszenzbilder zu erkennen. Mit diesem neuen LSFM-Typ demonstriere ich autonome Messungen der Spindel-Skalierung in sich frei entwickelnden Zebrafischembryonen.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:33666 |
| Date | 28 March 2019 |
| Creators | Berndt, Frederic Carl |
| Contributors | Guck, Jochen, Brugués, Jan, Huisken, Jan, Technische Universität Dresden |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/acceptedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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