Der Programmed Death-Ligand 1 (PD-L1) wird von verschiedenen Tumorentitäten überexprimiert und hemmt durch die Bindung an das auf T-Zellen vorkommende Programmed Cell Death Protein (PD-1) die Immunantwort. Immuncheckpoint-Inhibitoren sind in der Lage, diese Blockade aufzubrechen und die Immunantwort zu reaktivieren. Auf eine solche Monotherapie sprechen aber nur etwa 30 % der Patienten an, sodass klinischer Bedarf an nichtinvasiven, bildgebenden Diagnosemethoden besteht. Eine Möglichkeit stellen Radioliganden für die nichtinvasive Bildgebung mittels Positronen-Emissions-Tomographie (PET) oder Einzelphotonen-Emissionscomputertomographie (SPECT) dar, welche einen Therapieerfolg prognostizieren könnten. Die vorliegende Dissertationsschrift beschäftigt sich mit der Entwicklung und Synthese einer neuen Klasse von PD-L1-adressierenden Radioliganden sowie deren biologischer Evaluierung in Zellen (in vitro) und in Kleintieren (in vivo).
Nach der Identifikation von drei hochaffinen PD-L1-Inhibitoren in der Patentliteratur, wurden zunächst diese als Referenzverbindungen in einer neuen, konvergenten Synthesestrategie dargestellt. Diese ermöglichte nicht nur eine höhere Gesamtausbeute der Substanzen, sondern erlaubte auch dank des modularen Aufbaus den einfachen Zugang zu einer großen Substanzbibliothek an PD-L1-Radioliganden. Mithilfe einer Kokristallstruktur aus PD-L1 und einem Inhibitor wurden Modifikationen des Inhibitors für eine Transformation in einen Radioliganden geplant. Zur Erhöhung der Hydrophilie der Substanzen wurden löslichkeitsvermittelnde Gruppen (Sulfon-/Phosphonsäuren) in dem Molekülteil eingeführt, welcher in der „Solvent-Exposed-Region“ des Proteins lokalisiert ist. Funktionalisierung des Bindungsmotivs mit einem Alkin erlaubte die Einführung eines Linker-Chelator-Konstruktes mittels kupferkatalysierter Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC) zur Komplexierung des Radiometalls.
In der ersten Generation an PD-L1-Radioliganden wurden zwei Bindungsmotive und drei verschiedenen Linker erprobt, sodass nach Konjugation mit dem DOTA-Chelator sechs PD-L1-Radioliganden zur Verfügung standen. Nach erfolgreicher Radiomarkierung mit 64Cu, 68Ga und 177Lu erfolgten mit den 64Cu-markierten Radioliganden Bindungsaffinitätsbestimmungen in einem Sättigungsbindungsassay (Zugabe von 2,5 % BSA im Medium) an transduzierten PC3 PD-L1-Zellen. Dabei erwies sich [64Cu]Cu-62 mit Dimethylbiphenyl als Bindungsmotiv und Piperazinpropyl als Linker mit einem KD-Wert von 60 nM als der vielversprechendste Radiotracer, sodass dieses Bindungsmotiv als Grundlage für die folgenden Radioliganden dienen sollte. Nach bestätigter In-vitro-Stabilität der Radioliganden in verschiedenen Medien (PBS, Humanserum, gegenüber Lebermikrosomen), wurden für alle sechs Verbindungen aus der ersten Generation µPET-Aufnahmen in tumortragenden Mäusen durchgeführt. Die Aufnahmen zeigten eine geringe Akkumulation im PD-L1-positiven Tumor, eine hepatobiliäre Ausscheidung trotz niedriger log D7,4-Werten von –2,73 bis –3,50 und für kleine Moleküle ungewöhnlich lange Zirkulationszeiten. Diese konnten mit Gelelektrophorese und Größenausschlusschromatographie auf eine ausgeprägte Albuminbindung der Radioliganden zurückgeführt werden. In Echtzeit-Radioliganden-Bindungsversuchen mittels LigandTracer® konnten für die meisten Radioliganden einstellige, nanomolare KD-Werte erzielt werden. In Abwesenheit von Albumin zeigen diese Bindungsaffinitäten mit hoher Wahrscheinlichkeit die reine Bindung an PD-L1.
Um die Tumoraufnahme zu erhöhen, wurden für die PD-L1-Radioliganden der zweiten Generation die funktionelle Gruppe am Pyridinring und das Halogen am zentralen Aromaten ausgetauscht. Trotz höherer KD-Werte in Sättigungsbindungsversuchen zeigten die µPET-Aufnahmen eine erhöhte Tumoraufnahme für das Brom- ([64Cu]Cu-115) und Iodderivat ([64Cu]Cu-116), vermutlich aufgrund höherer Bmax-Werte. Um eine Transchelatierung zu vermeiden, wurde für die PD-L1-Radioliganden der dritten Generation DOTA gegen NODA-GA als Chelator ausgetauscht. Außerdem wurde auf eine Verbesserung des pharmakokinetischen Profils abgezielt: Mittels Einführung von weiteren Sulfonsäuren und deren partiellen Austausch durch Phosphonsäuren sollte zum einen die Albuminbindung verringert und zum anderen die renale Ausscheidung begünstigt werden. Die sechs Radioliganden mit bis zu vier Sulfon-/Phosphonsäuren zeigten, abhängig von der Art und Anzahl der löslichkeitsvermittelnden Gruppe, stark unterschiedliche pharmakokinetische Profile. Dabei überzeugte der Radioligand [64Cu]Cu-148 mit einem KD-Wert von 94 nM im Sättigungsbindungsversuch und einem log D7,4-Wert von –3,80 insbesondere in der µPET-Bildgebung: Größtenteils renale Ausscheidung, moderate Tumoraufnahme (SUVmax = 3,5) und ausgeprägtes Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis zum PD-L1-negativen Tumor.
Die vierte Generation sollte das wünschenswerte pharmakokinetische Profil des Radioliganden [64Cu]Cu-148 mit den höheren Bmax-Werten der Radioliganden der zweiten Generation kombinieren. Die µPET-Aufnahmen zeigten für alle vier synthetisierten Radioliganden sehr geringe Tumoraufnahmen, dafür ein unerwartetes pharmakokinetisches Profil mit hoher Leberaufnahme – trotz niedriger log D7,4-Werte – und eine Akkumulation in Knochen/Knochenmark und Gelenken. Es wird vermutet, dass es trotz des räumlichen Abstandes der beiden Phosphonsäuren zu einer Ca2+-vermittelten Knochenanreicherung und/oder einer Bindung an anderen biologischen Strukturen wie Makrophagen kommt.
Dank des modularen Aufbaus und der Einführung einer Alkin-Funktionalität wird über 18F-prosthetische Gruppen ein einfacher Zugang zu 18F-Radioliganden mittels CuAACReaktionen eröffnet, für welche bereits 19F-Referenzverbindungen und Markierungsvorläufer synthetisiert wurden. Nach weiteren Optimierungen des pharmakokinetischen Profils und damit kürzeren Zirkulationszeiten soll dies zukünftig den Zugang zu vielversprechenden 18F-Radiotracern ohne Chelator-Linker-Einheit ermöglichen.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:86938 |
| Date | 29 August 2023 |
| Creators | Krutzek, Fabian |
| Contributors | Kopka, Klaus, Ermert, Johannes, Technische Universität Dresden, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf, Deutsches Krebsforschungszentrum |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
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| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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