Orientadora : Profª Drª Giseli Klassen / Co-orientadora : Profª Drª Edneia A. S. R. Cavalieri / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia. Defesa: Curitiba, 02/12/2014 / Inclui referências / Área de concentração / Resumo: O câncer de mama é o tipo de câncer mais frequente entre as mulheres em todo o mundo. A enzima MMP-2 é uma metaloprotease capaz de degradar o colágeno tipo IV, um dos principais constituintes da matriz extracelular (MEC). Sua função é amplamente descrita por atuar no mecanismo de metástases em diversos tipos de câncer. Estudos recentes demonstraram que a linhagem tumoral de mama
MCF7 possui o gene MMP2 regulado por metilação do DNA. Além disso, alguns estudos têm demonstrado que a fibronectina, uma importante proteína
constituinte da MEC, é capaz de promover a expressão de MMP-2 em linhagens tumorais de mama. Resultados recentes do nosso grupo mostraram que a linhagem tumoral MCF7 quando tratada com fibronectina por 5 horas sofre 30% de desmetilação da região promotora do gene MMP2. Entretanto, observou-se também que tal processo foi transitório, porque houve a remetilação parcial do promotor quando o estímulo foi retirado. Ainda, a fibronectina induziu o aumento de uma marca de histona no promotor de MMP2 que sinaliza para a ativação da transcrição gênica. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi dar continuidade a esse estudo, avaliando a regulação epigenética do gene MMP2 em linhagens tumorais de mama após o cultivo com fibronectina em diferentes tempos. Para isso, células da linhagem MCF7 submetidas ao tratamento com fibronectina por 8, 12 e 24 horas, e da linhagem MDA-MB-436 por 24 horas, tiveram seus níveis de expressão de MMP2, metilação do DNA e modificações de histonas do promotor do gene avaliados. Na linhagem MCF7, o tratamento por 8, 12 e 24 horas foi capaz de promover o aumento da expressão de MMP2 em 7, 25 e 9 vezes, respectivamente, comparado com o controle, assim como a redução da metilação do promotor de 90% (controle) para 70%, 40% e 52%, respectivamente. O tratamento por 24h também promoveu o aumento da marca de ativação gênica H3K4me3. Ainda, após 12h de cultivo com fibronectina, a linhagem MCF7 aumentou sua capacidade migratória. A fim de verificar se o efeito observado não era exclusivo da linhagem MCF7, foi incluída no estudo a linhagem MDA-MB-436 que foi submetida ao tratamento por 24h, e apresentou aumento na expressão gênica de MMP2 (4 vezes) e redução da metilação do promotor (de 90% para 22%). Por fim, as células tratadas foram mantidas em cultivo sem a fibronectina para avaliar a estabilidade das modificações. Essas células, chamadas de recultivo, apresentaram uma redução na expressão gênica e aumento na metilação do promotor quando comparadas com as células logo após os tratamentos, confirmando o efeito transitório da fibronectina nos eventos epigenéticos, que já tinha sido observado após 5 horas de tratamento. Esses
dados corroboram e complementam os mecanismos observados pelo nosso
grupo de pesquisa e contribuem para a compreensão dos mecanismos
epigenéticos que regulam a expressão de um importante gene associado às
metástases tumorais.
Palavras-chave: Câncer de mama, MMP-2, epigenética, metilação do DNA. / Abstract: Breast cancer is the most common cancer worldwide among women. The MMP-
2 enzyme is a metalloprotease capable of degrading type IV collagen, a major
constituent of the extracellular matrix (ECM). Its function is widely described by
acting in the mechanism of metastasis in various cancers. Recent data has
shown that the MCF7 breast tumor cell line has the MMP2 gene regulated by
DNA methylation. In addition, some studies have shown that fibronectin, an
important constituent of the extracellular matrix, is capable of promoting MMP-2
expression in breast tumor cell lines. Recent results from our group showed that
fibronectin was able to induce MMP2 expression by a 30% decrease in its
promoter methylation in MCF7 tumor cell line. However, it was also noted that
this process was transient, because a partial promoter remethylation was
observed when the stimulus was removed. Moreover, a histone marker for an
open chromatin conformation was significantly increased. Therefore, the aim of
this work was to continue evaluating the epigenetic regulation of the MMP2 gene
after cultivation of breast tumor cell lines with fibronectin at different times. To this
reason, MCF7 cells subjected to treatment with fibronectin for 8, 12 and 24 hours
and MDA-MB-436 cells subjected to treatment for 24 hours, were evaluated by
the levels of MMP2 expression, gene promoter DNA methylation and histone
modifications. In the MCF7 cell line, treatments for 8, 12 and 24 hours were able
to promote 7, 9 and 25-fold increase in MMP2 expression, respectively,
compared with the mock. In addition, promoter methylation was reduced from
90% (control) to 70%, 40% and 52%, respectively. Treatment for 24h also
promoted an increase of the histone open chromatin conformation marker
H3K4me3. Moreover, the migratory capacity of MCF7 cells treated for 12h was
increased. In order to confirm the fibronectin effect, the MDA-MB-436 cell line
was subjected to 24h fibronectin treatment, which showed an increase in MMP2
gene expression (4-fold) and a reduction of promoter methylation (from 90% to
22%). Finally, the treated cells were kept in culture without fibronectin to evaluate
the modifications stability. These cells (recultivation) showed a gene expression
reduction and promoter methylation increased when compared to the cells after
treatments, confirming the fibronectin transient effect observed after the 5h
treatment. These data support and complement the mechanisms observed by
our research group and contribute to understand the epigenetic mechanisms that
regulate the expression of an important gene associated with tumor metastasis.
Keywords: Breast cancer, MMP-2, epigenetics, DNA methylation.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:dspace.c3sl.ufpr.br:1884/37321 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Pereira, Isabela Tiemy |
| Contributors | Klassen, Giseli, Cavalieri, Edneia Amancio de Souza Ramos, Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | 72f. : il. algumas color., grafs., tabs., application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPR, instname:Universidade Federal do Paraná, instacron:UFPR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | Disponível também em formato digital |
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