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Previous issue date: 2017-03-31 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O milho (Zea mays) é considerado uma espécie modelo nos estudos citogenéticos de plantas. Contudo, existem dificuldades em se obter cromossomos metafásicos de qualidade e em quantidade. A sincronização celular com hidroxiureia (HU) seguida da utilização de agentes bloqueadores do ciclo celular sob pressão negativa de vácuo podem ser eficazes para alcançar um alto índice metafásico. Além disso, diferenciar metáfases com cromossomos bloqueados dos não bloqueados é uma prática essencial para se obter cromossomos com morfologia delimitada para a montagem do cariograma. O objetivo do presente trabalho foi desenvolver um protocolo para obtenção de alto índice metafásico apresentando cromossomos bem distendidos e de qualidade citogenética em quantidades suficientes para serem disponibilizados em aplicações que envolvam técnicas moleculares e genômicas em Zea mays. As raízes de milho foram tratadas no experimento I sem sincronização celular, que consistiu de 4 tratamentos: T1: sem APM e sem pressão negativa de vácuo; T2: sem APM com pressão negativa de vácuo (-570 mmHg); T3: com APM e com pressão negativa de vácuo e T4: com APM sem pressão negativa de vácuo. Os períodos de tempo de cada tratamento foram: 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36 e 40 min. As raízes foram tratadas com Feulgen e em seguida realizou-se a digestão enzimática, esmagamento celular e análise de imagens do material sobre a lâmina. Os experimentos II e III consistiram de células sincronizadas com ação da HU. Após as análises das contagens de células do experimento I, os tempos de 32 minutos com APM com vácuo e 40 minutos com APM sem vácuo foram selecionados para dar continuidade conforme seus os índices mitóticos e metafásicos. Os experimentos II e III consistiram no tempo de recuperação das raízes, porém com a utilização de 1,75mM de HU. Os tempos de recuperação variaram em períodos de 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270 e 300 minutos com 3 raízes retiradas a cada intervalo de tempo. Os procedimentos de fixação, visualização do DNA, digestão enzimática e esmagamento, captura e análise das imagens seguiram os mesmos passos do experimento I. As raízes absorveram APM suficiente para bloquear o ciclo celular no período de tempo máximo de 40 minutos. Após a sincronização do ciclo celular, a porcentagem média de metáfases aumentou principalmente no tratamento T1 (32 min. com APM e vácuo) do experimento II após 4 horas de recuperação com 33,15 % de metáfases. Foi possível discriminar metáfases bloqueadas das não bloqueadas, com base na morfologia dos cromossomos, constrições bem visíveis e níveis de compactação cromossômica. A pressão negativa de vácuo permitiu obter metáfases em quantidade e qualidade suficientes para serem aplicados em técnicas de bandeamento, análises genômicas e citomoleculares. / Corn (Zea mays) is considered a model species in cytogenetic studies of plants. However, there are difficulties in obtaining metaphasic chromosomes of quality and quantity. The cell synchronization with hydroxyurea (HU) followed using cell cycle blocking agents under negative vacuum pressure may be effective to achieve a high metaphase index. In addition, differentiating metaphases with blocked chromosomes from unlocked chromosomes is an essential practice for obtaining chromosomes with delimited morphology for a cariogram montage. The objective of the present work was to develop a protocol to obtain a high metaphase index presenting well distended and cytogenetic chromosomes in sufficient quantity to be available in applications that involve molecular and genomic techniques in Zea mays. The maize roots were treated without experiment I without cell synchronization, which consisted of 4 treatments: T1: without APM and without negative vacuum pressure; T2: no APM with negative vacuum pressure (-570 mmHg); T3: with APM and with vacuum negative pressure and T4: with APM without negative vacuum pressure. The time periods of each treatment were: 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36 and 40 min. The roots were treated with Feulgen and instead enzymatic digestion, cellular crushing and image analysis of the material on a slide were performed. Experiments II and III consisted of cells synchronized with HU action. After analysis of the cell counts of experiment I, the 32 minute times with APM with vacuum and 40 minutes with APM without vacuum were selected to give continuity according to their mitotic and metaphase indices. Experiments II and III consisted in root recovery time, but with a use of 1.75 mM of HU. The recovery times varied in periods of 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270 and 300 minutes with 3 roots removed at each time interval. The procedures of fixation, DNA visualization, enzymatic digestion and crushing, capture and analysis of the images were the same as the synchronization. The roots absorbed sufficient APM to block the cell cycle in the maximum time period of 40 minutes After a cell cycle synchronization, a mean percentage of metaphases increased without T1 treatment (32 min with APM and vacuum) from experiment II after 4 hours of recovery with 33.15% of metaphases. It was possible to discriminate blocked metaphases from unlocked ones, based on chromosome morphology, conspicuous constrictions and levels of chromosome compaction. Negative vacuum pressure allowed to obtain metaphases in sufficient quantity and quality to be applied in banding techniques, genomic and cytomological analyzes.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:localhost:123456789/16368 |
| Date | 31 March 2017 |
| Creators | Miranda, Daniel Pereira |
| Contributors | Clarindo, Wellington Ronildo, Bhering, Leonardo Lopes, Carvalho, Carlos Roberto de |
| Publisher | Universidade Federal de Viçosa |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFV, instname:Universidade Federal de Viçosa, instacron:UFV |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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