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Previous issue date: 2013-04-16 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O objetivo geral deste trabalho foi caracterizar fisiologicamente e identificar proteínas diferencialmente expressas e fosforiladas em raízes de genótipos de soja contrastantes para tolerância à seca, sendo um tolerante (Embrapa 48) e um sensível (BR 16), de forma a melhor entender os mecanismos de resposta e identificar proteínas candidatas no desenvolvimento de estratégias para aumento da tolerância à seca. As plantas foram avaliadas em condições de plena irrigação (controle) e sob déficit hídrico imposto pela suspensão da irrigação até que as plantas atingissem os potenciais hídricos na antemanhã (Ψam) de -1,0 MPa (moderado) e -1,5 MPa (severo). As análises fisiológicas mostraram que esses cultivares exibem mecanismos diferenciais em resposta ao déficit hídrico. O cultivar Embrapa 48 retardou a desidratação em dois dias, mantendo A, ETR e ΦPSII maior mesmo sob déficit. Este resultado não foi relacionado a alterações na gs ou na composição isotópica do 13C, sugerindo a importância na condutividade hidráulica nesta tolerância, e a uma maior indução do crescimento radicular sob deficiência hídrica. Além disso, em folhas, apresentou menor dano oxidativo e a análise de perfil metabólico evidenciou um maior ajuste osmótico pelo acúmulo de açúcares e aminoácidos. Nas raízes, apresentou maior acúmulo de ácidos orgânicos, intermediários da glicólise e Ciclo de Krebs, além de aminoácidos. O cultivar tolerante também apresentou maiores níveis foliares e radiculares de ABA. Houve uma manutenção do crescimento radicular no tolerante e redução do crescimento relativo da parte aérea. A enxertia recíproca confirmou a importância da condutividade hidráulica no mecanismo de tolerância do genótipo tolerante, indicando o sistema radicular como um dos principais fatores que contribuem para a maior tolerância nesse cultivar. As proteínas diferencialmente expressas e fosfoproteínas foram analisadas através de 2D-SDS PAGE e detectadas com CCB (proteínas diferenciais) e Pro-Q DPS (proteínas fosforiladas) associadas a identificação por MS. A análise diferencial das proteínas de raízes revelou mecanismos de tolerância ao déficit hídrico relacionado aos mecanismos de respiração, metabolismo antioxidativo, metabolismo secundário e metabolismo de aminoácidos, entrando em conformidade com as diferenças encontradas no perfil metabólico. O fosfoproteoma apresentou uma correlação com o proteoma diferencial na ausência e na presença de déficit severo com muitas proteínas comuns às duas abordagens. A respiração foi o grupo cuja fosforilação foi fortemente afetada em resposta à seca, sendo representada por 12 proteínas. Adicionalmente, várias enzimas da respiração, síntese de aminoácidos e mecanismo antioxidativo, tiveram aumento em sua fosforilação sem apresentar alterações em sua abundancia, providenciando mais evidencias para a resposta diferencial da respiração na tolerância a seca em soja. A análise conjunta somente no genótipo tolerante permitiu observar que o aumento da fosforilação de uma proteína pode ser transiente com o estresse. Os resultados também sugerem um papel adicional do ABA na resposta ao estresse hídrico, induzindo cascatas cinases e aumentando a respiração para permitir a menor redução crescimento radicular em resposta a seca, o que poderia explicar o maior volume radicular observado no cultivar tolerante sob seca. A fosforilação participa nas características do proteoma com maiores níveis na abundancia e na fosforilação em muitas proteínas no tolerante. Estes resultados reforçam a visão de que a tolerância à seca é uma herança quantitativa, onde vários mecanismos estão envolvidos. / The goal of this work was the physiological comparison and identification of proteins differentially expressed and phosphorylated in roots of soybean plants with contrasting tolerance to drought (Embrapa 48, tolerant, BR 16, sensitive) with the ultimate aim of improving our understanding of the mechanisms involved in water deficit responses and identifying candidate proteins for stress tolerance engineering. Plants were evaluated under irrigated conditions (control) and under water deficit imposed by the suspension of irrigation until plants reached pre-dawn water potentials (Ψam) of -1.0 MPa (moderate) or - 1.5 MPa (severe). Physiological analyses indicate that the two cultivars exhibit different responses to water deficit. The Embrapa 48 cultivar showed a two days delay in dehydration, maintaining greater values of A, ETR and ΦPSII even under water deficit. This result was not related to alterations in gs or in 13C isotope composition, suggesting that hydraulic conductivity and induction of root growth might be important factors for this tolerance. In addition, leaves of Embrapa 48 exhibited less oxidative damage and an adjustment in metabolite profile with a higher accumulation of sugars and amino acids. Metabolite profiling of roots indicated greater accumulation of organic acids, glycolytic and Krebs cycle intermediates as well as amino acids. The tolerant cultivar also presented increased levels of ABA in both leaves and roots. Induction of root growth occurred in the tolerant cultivar with a decrease in relative growth of the aerial parts of these plants. Reciprocal grafting experiments confirmed the importance of hydraulic conductance in the tolerance mechanism of Embrapa 48, indicating the root system as one of the major factors that contributes to the greater tolerance of this cultivar. Differentially expressed proteins and phosphoproteins were analysed using 2D-SDS-PAGE, detected using CCD (differentially expressed proteins) or Pro-Q DPS (phosphorylated proteins) and identified by mass spectrometry. Differential analysis of root proteins revealed a relationship between tolerance to drought and respiration, antioxidant metabolism, secondary metabolism and amino acid metabolism, in agreement with the metabolite profiling experiments. The phosphoproteomic analysis indicated a correlation with the differential proteomic approach in the absence and presence of severe water deficit with many proteins common to the two methods. Respiration was the group in which phosphorylation was strongly affected in response to lack of water, being represented by 12 proteins. Additionally, several enzymes of respiration, synthesis of amino acids and antioxidative mechanism, had increased in its phosphorylation without changes in their abundance, providing more evidence for differential response of respiration in drought tolerance without soybean. The combined analysis for the tolerant genotype indicated that the increase in phosphorylation of a protein can be transient with the stress. The results here suggest a new role for ABA in water deficit, inducing kinase cascades and inducing respiration in order to allow lower reductions in root system under drought. The phosphorylation participates in the characteristics of the proteome with higher levels in abundance and phosphorylation of many proteins in tolerant. Altogether, data reinforce the view that drought tolerance is a quantitative trait, where several mechanisms are involved. / Tese enviada pela secretaria do curso por e-mail, em 28-03-17.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:localhost:123456789/9922 |
| Date | 16 April 2013 |
| Creators | Mesquita, Rosilene Oliveira |
| Contributors | Ramos, Humberto Josué de Oliveira, Loureiro, Marcelo Ehlers |
| Publisher | Universidade Federal de Viçosa |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFV, instname:Universidade Federal de Viçosa, instacron:UFV |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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