Cryptococcus gattii é um patógeno emergente que infecta principalmente indivíduos imunocompetentes, causando criptococose. Dentre os tratamentos estão anfotericina B e fluconazol, porém são insuficientes na erradicação da doença. A estimulação da resposta imune por vacinas de DNA em diversos modelos fúngicos vem sendo relatados. Dentre as proteínas fúngicas candidatas no desenvolvimento de vacinas estão às proteínas 14-3-3, as quais foram identificadas como proteínas imudominantes em estudos de proteômica de Cryptococcus neoformans e C. gattii e em soro de pacientes com criptococose. O objetivo deste estudo foi realizar a construção do vetor recombinante contendo a região codificante do gene 14-3-3, seguido da análise preliminar da resposta imune em camundongos imunizados. A região codificante do 14-3-3 foi clonada em vetor de expressão eucariótico pcDNA3.1(+) e a funcionalidade do vetor recombinante foi confirmada a nível transcricional por RT-PCR a partir de células A549 transfectadas com a vacina de DNA e a nível traducional por imunobloting. A proteína 14-3-3 foi ainda localizada na parede celular da levedura, revelado por metodologias de microscopia por imunofluorescência. A porção codificante do gene 14-3-3 de C. gattii foi clonada em vetor de expressão pET23-d e a proteína recombinante foi expressa em células de E. coli BL21 e purificada por cromatografia de afinidade a níquel. A resposta imune humoral foi determinada por dosagem de imunoglobulinas, porém não ocorreu diferença estatística na indução de imunoglobulinas totais em camundongos inoculados com a vacina. Assim esse trabalho contribuiu para o estudo imunogenicidade da proteína 14-3-3 em C. gattii permitindo possíveis estudos em outros modelos animais usando a mesma estratégia profilática. / Cryptococcus gattii is an emerging pathogen that mainly infects immunocompetent individuals, causing cryptococcosis. Among the treatments are amphotericin B and fluconazole, but they have proven insufficient in eradicating this disease. The immune responses stimulation by DNA vaccines in several fungal models has been reported. Among fungal candidate proteins in vaccine development are the 14-3-3 proteins, which were identified as immunodominant sera proteins in Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii proteomics and in serum of patients with cryptococcosis. The study aimed to construct a recombinant vector containing the 14-3-3 coding region, followed by the immune response preliminary analysis of immunized mice. The 14-3-3 gene was cloned into a eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+) vector and RT-PCR confirmed the recombinant transcriptional level functionality from A549 transfected with DNA vaccine cells and translational level by immunoblotting. The 14-3-3 protein was localized associated with the yeast cell wall, as revealed by immunofluorescence microscopy. The coding portion of the 14-3-3 C. gattii gene was cloned into pET23-d expression vector and the recombinant protein was expressed in E. coli BL21 and purified by nickel affinity chromatography. The humoral immune response was determined by serum total immunoglobulin measurements, but no statistical differences were observed in total immunoglobulins from vaccine-inoculated mice. Thus, this research contributed to 14-3-3 C. gattii protein immunogenicity study, allowing possible researches in other animal models applying the same prophylactic strategy.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:lume56.ufrgs.br:10183/117890 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Mingori, Moara Rodrigues |
| Contributors | Vainstein, Marilene Henning |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGS, instname:Universidade Federal do Rio Grande do Sul, instacron:UFRGS |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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