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Previous issue date: 2010-03-26 / Paracoccidioides brasiliensis, a thermodimorphic fungus, is the causative agent of the most
prevalent systemic mycosis in Latin America, paracoccidioidomycosis. The phospholipase B
(PLB) enzyme is considered an important virulence factor in this dimorphic fungus, involved
in the immune response of the host-pathogen interaction. Our objective was to determine
whether a P. brasiliensis (Pb18) PLB is involved in adhesion / internalization of yeast and
evasion of host immune responses. The effect of PLB was analysed using specific inhibition
of PLB (alexidine dihydrochloride) and pulmonary surfactant in an ex vivo model (Pb18) of
alveolar macrophage (MHS cells) infection. PLB enzyme assays and real time RT-PCR (qRTPCR)
analysis of genes differentially expressed in the process of evasion: plb1 (phospholipase
B1), icl1 (isocitrate lyase) and sod3 (Cu, Zn dismutase) and immune responses: clec2 (C-type
lectin domain 2), cd14 (cluster of differentiation 14), tlr2 (toll-like receptor 2), nfkb (nuclear
factor kappa B), nkrf (NF-kappaB repressing factor), il1β (inteleukin-1β) and tnfα (tumor
necrosis factor alpha) were carried out using selective inhibition of PLB activity and
pulmonary surfactant. The levels of cytokines inteleukin 10 (IL-10), IL-12 and TNF-α) were
also determined by ELISA. PLB activity under adhesion conditions of P. brasiliensis (Pb18)
to alveolar macrophage cells was found at high levels up to 6 hours post-infection. In the
conditions of exposure to pulmonary surfactant and alexidine dihydrochloride, PLB activity
and the level of transcripts of genes related to phagocytosis and inflammatory response were
measured. We found that PLB activity had an influence on the phagocytic activity of alveolar
macrophages. Alexidine dihydrochloride (0,25 μM) selectively inhibited PLB activity by 66%
and decreased significantly the adhesion and internalization of yeast on MHS cells. Genes
involved in phagocytosis (trl2 and cd14) and inflammatory response (nrkf, tnfα and il1β) were
down-regulated in the presence of the PLB inhibitor. In contrast, the PLB activity and
internalization of fungal yeast cells increased significantly in the presence of pulmonary
surfactant (100 μg/mL) and genes such as clec2, important for effective phagocytosis by MHS
cells, and the pro-inflammatory inhibitor (nkrf) were up-regulated. Also, the pulmonary
surfactant did not alter cytokine production, while alexidine dihydrochloride decreased the
levels of IL-10 and increased the levels of IL-12 and TNF-α. In addition, through
simultaneous analyses of gene expression for the pathogen, P. brasiliensis, we found upregulation
of the genes sod3, icl1 and plb1, required for the evasion of alveolar macrophages.
P. brasiliensis PLB is important for the binding and internalization of yeast at macrophage
surfaces. The specific effect of inhibiting PLB enzyme activity indicates that adhesion may be
facilitated indirectly via fatty acid release from phospholipids of the membrane of host cells.
This is the first study to show that PLB activity may modulate immune responses to P.
brasiliensis infection. / Paracoccidioides brasiliensis, fungo dimórfico, é o agente etiológico principal micose
sistêmica da América Latina, paracoccidioidomicose. A enzima fosfolipase B (PLB) é
considerada um importante fator de virulência nesse fungo dimórfico e está envolvida na
resposta imune da interação patógeno-hospedeiro. Nosso objetivo foi determinar se a PLB de
P. brasiliensis (Pb18) está envolvida na adesão e internalização de leveduras e na evasão da
resposta imune hospedeira. O efeito da PLB foi analisado usando o inibidor seletivo de PLB
(alexidine dihydrochloride) e o surfactante pulmonar (Survanta) em um modelo ex vivo de
infecção de macrófagos alveolares (MHS) com Pb18. Ensaio enzimático de PLB e análise de
genes diferencialmente expressos por RT-PCR em tempo real (qRT-PCR) no processo de
evasão: plb1 (fosfolipase B1), icl1 (isocitrato liase) e sod3 (Cu, Zn dismutase); e na resposta
imune: clec2 (lecitina tipo-C 2), cd14 (cluster de diferenciação 14), tlr2 (receptor toll-like 2),
nfkb (fator nuclear kappaB), nkrf (repressor fator nuclear kappaB), il1β (interleucina- 1 beta) e
tnfα (fator de necrose tumoral alfa) foram realizados usando o inibidor seletivo da atividade
de PLB e surfactante pulmonar. Os níveis de citocinas interleucina 10 (IL-10), IL-12 e TNF-
α) foram determinados por ELISA. A atividade de PLB usadas em baixas condições para a
adesão de P. brasiliensis (Pb18) obteve altos níveis em 6 horas pós-infecção. Na presença do
surfactante pulmonar e alexidine dihydrochloride, a atividade da PLB e os níveis de
transcritos dos genes relacionados à fagocitose e à resposta inflamatória foram quantificados.
A PLB teve influência na atividade fagocítica dos macrófagos. Alexidine dihydrochloride
(0,25 μM) inibiu seletivamente a atividade PLB em 66% e diminuiu significativamente a
adesão e internalização de leveduras por macrófagos alveolares (MHS). Genes envolvidos na
fagocitose (trl2 e cd14) e resposta inflamatória (nrkf, tnfα e il1β) foram reprimidos na
presença do inibidor de PLB. Em contraste, a atividade PLB e internalização de leveduras
aumentou significativamente na presença do surfactante pulmonar (100 μg/mL) e genes assim
como clec2, importante para uma fagocitose efetiva pelos macrófagos alveolares (MHS), e o
inibidor pró-inflamatório (nkrf) foram induzidos. Entretanto, o surfactante pulmonar não
alterou a produção de citocinas, enquanto que alexidine dihydrochloride diminuiu os níveis de
IL-10 e aumentou os níveis de IL-12 e TNF-α. Em adição, nas análises simultâneas de
expressão de genes, P. brasiliensis, houve indução dos genes sod3, icl1 e plb1, requeridos
para a evasão dos macrófagos alveolares. A PLB de P. brasiliensis é importante na adesão e
internalização de leveduras pelos macrófagos alveolares. O efeito específico da inibição da
atividade da PLB indica que a adesão pode ser facilitada indiretamente via liberação de ácidos
graxos dos fosfolipídeos de membrana das células hospedeiras. Esse é o primeiro estudo
mostrando que a atividade da PLB pode modular a resposta imune à infecção pelo P.
brasiliensis.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.bc.ufg.br:tde/1296 |
| Date | 26 March 2010 |
| Creators | SOARES, Deyze Alencar |
| Contributors | SILVA, Silvana Petrofeza da |
| Publisher | Universidade Federal de Goiás, Mestrado em Biologia, UFG, BR, Ciências Biolóicas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFG, instname:Universidade Federal de Goiás, instacron:UFG |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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