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Previous issue date: 2016-03-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The protein profile of hornless Nellore cattle from a segregating population for meat tenderness of
extremes shear force, low extreme group (M) and extreme high (D) group, showed differentially
expressed proteins. They had greater relative abundance of proteins of the glycolytic process in
group M and proteins of the oxidative metabolism evidenced more expressed in group D, fact that
probably is correlated to the final tenderness of the meat. Only identified in group D, the
cytochrome c protein indicates induction of the apoptotic process in this group of animals.
Structural proteins were identified in group M, indicating a possible greater proteolysis. Calpastatin
was only identified in group D, this protein is highly related to the final meat tenderness because it
is a natural inhibitor of the calpain. Separation of calpastatin by ion exchange column
chromatography of two different muscles described two peaks of calpain inhibitory activity: peak 1
(CAST1) and peak 2 (CAST2). CAST 1 activity increased during the post-mortem period in
Triceps brachii and showed no difference between days in Longissimus dorsi and on the other
hand, total activity of calpastatin and CAST 2 decreased during post-mortem aging. The 115 kDa
band of calpastatin decreased its intensity during post-mortem aging in both muscles with more
than 70% of the change occurring on the first day. The mitochondrial ATP synthase beta subunit
proteins increased and Succinyl CoA ligase decreased after aging and Adenylate kinase isoenzyme
decreased on day 7. Calpastatin peaks had weak phosphorylated bands and had different IP and
MW patches than 2D-SDS -PAGE. During the purification process of the calpastatin peaks the
activity per mg of protein increased but lost half of the total activity presented during the first
purification step. For peak 2 of calpastatin the specific activity increased 139.8 times and at the end
of this process 36% of the total activity remained. Purified calpastatin was identified on the
second-size gel having a molecular weight similar to the western blot. Spots from calpastatin peak
1 and two from calpastatin peak 2 were identified as peptides belonging to the calpastatin
molecule. Sequence of peptides identified in Spot from purified peak 1 as part of the inhibitory
domain III and IV and of the C-terminus and from the purified peak 2 a sequence of peptides
identified as part of the inhibitory domain I, II and III. These results lead us to believe that both
peaks, in this case, are degradation products of the intact molecule, and probably the small peptides
are broken down during the process. The results of the present study show that purification of
distinct forms of active calpastatin is possible, however, the intact form of calpastatin was not
present in this purification. The presence of peptides was not conclusive to determine the origin
and composition of each active peak. / O perfil protéico de animais da raça nelore mocho de uma população segregante para a maciez da
carne de extremos valores de força de cisalhamento, grupo extremo baixo (M) e grupo extremo alto
(D), apresentou proteínas diferentemente expressas as quais houve maior abundância relativa de
proteínas do processo glicolítico no grupo M e proteínas do metabolismo oxidativo evidenciadas
mais expressas no grupo D, fato que provavelmente está correlacionado à maciez final da carne.
Apenas identificada no grupo D, a proteína citocromo c indica indução do processo apoptótico
neste grupo de animais. Proteínas estruturais foram identificadas no grupo M, indicando uma
possível maior proteólise. A calpastatina foi somente identificada no grupo D, esta proteína está
altamente relacionada com a maciez final da carne por ser inibidora natural das calpaínas. A
separação de calpastatina por cromatografia em coluna de troca iônica de dois músculos diferentes
descreveu dois picos de actividade inibitória de calpaínas: pico 1 (CAST1) e pico 2 (CAST2).
Atividade de CAST 1 aumentada durante o período post mortem no Triceps brachii e não apresentou diferença entre os dias em Longissimus dorsi e por outro lado, a atividade total de
calpastatina e CAST 2 diminuiu durante o envelhecimento post mortem. A banda de 115 kDa da
calpastatina diminuiu sua intensidade durante o envelhecimento post mortem em ambos os
músculos com mais de 70% da alteração ocorrendo no primeiro dia. As proteínas mitocondriais da
subunidade ATP sintase beta aumentaram e a Succinil-CoA ligase diminuiu após o envelhecimento
e a Adenilato quinase isoenzima diminuiu no dia 7. Os picos de calpastatina apresentavam faixas
fosforiladas fracas e apresentavam manchas em IP e MW diferentes do que 2D-SDS-PAGE.
Durante o processo de purificação dos picos de calpastatina a actividade por mg de proteína
aumentou mas perdeu metade da atividade total apresentada durante a primeira etapa de
purificação. Para o pico 2 de calpastatina a actividade específica aumentou 139,8 vezes e no final
deste processo permaneceu 36% da atividade total. A calpastatina purificada foi identificada no gel
de segunda dimensão com um peso molecular semelhante ao western blot. Spots do pico 1 da
calpastatina e dois do pico 2 da calpastatina foram identificados como peptídeos pertencentes à
molécula da calpastatina. Sequêcia de peptídeos identificados em Spot a partir do pico 1 purificado
como parte do domínio inibidor III e IV e do terminal C e do pico 2 purificado uma sequêcia de
peptideos identificados como parte do domínio inibidor I, II e III. Estes resultados levam-nos a crer
que ambos os picos, neste caso, são produtos de degradação da molécula intacta e, provavelmente,
os pequenos peptideos são quebrados durante o processo. Os resultados do presente estudo
mostram que é possível a purificação de formas distintas de calpastatina activa, contudo a forma
intacta de calpastatina não estava presente nesta purificação. A presença de peptídeos não foi
conclusiva para determinar a origem ea composição de cada pico ativo.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.bc.ufg.br:tede/7099 |
| Date | 24 March 2016 |
| Creators | Oliveira, Leonardo Guimarães de |
| Contributors | Padua, João Teodoro, Ferreira, Reginaldo Nassar, Padua, João Teodoro, Costa, Marcos Fernando Oliveira e, Bailão, Alexandre Melo, Borges, Clayton Luiz, Prado, Cristiano Sales |
| Publisher | Universidade Federal de Goiás, Programa de Pós-graduação em Ciência Animal (EVZ), UFG, Brasil, Escola de Veterinária e Zootecnia - EVZ (RG) |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFG, instname:Universidade Federal de Goiás, instacron:UFG |
| Rights | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 4581960685150189167, 600, 600, 600, 600, -6217552114249094582, -7513779660372594992, 2075167498588264571 |
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