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Previous issue date: 2014-07-24 / FACEPE / O nanoporo protéico unitário formado pela alfatoxina de Staphylococcus aureus pode ser
empregado como elemento de reconhecimento molecular no desenvolvimento de
biossensores, espectrômetro de massas e seqüenciadores de DNA. Genericamente o processo
de reconhecimento molecular ocorre com a interação analito-nanoporo devido à entrada ou
permeação de moléculas unitárias no lume aquoso do nanoporo. A presença de uma molécula
do analito no interior do nanoporo provoca alterações discretizadas na corrente iônica. A
análise da série temporal funciona como “impressão digital” da molécula ocupante ou
permeante do nanoporo. A altíssima velocidade de translocação do DNA através do nanoporo
ainda é uma dificuldade para o sequenciamento preciso e confiável destas moléculas. Neste
trabalho avaliou-se como o aumento da viscosidade e a presença de íons da série de
Hofmeister no meio aquoso influenciam na interação DNA-nanoporo, visando encontrar as
condições adequadas que favoreçam a detecção diferencial de cada uma das bases
nucleotídicas. A confecção da bicamada lipídica plana e a inserção do nanoporo unitário na
membrana, bem como os registros de correntes iônicas através dos poros foram obtidas em
condições de fixação de voltagem. Todos os experimentos foram realizados a 25OC. Na
solução banhante do nanoporo utilizou-se alguns ânions da família VIIA, juntamente com o
K+, e alguns dos cátions da família IA juntamente com o Cl-, todos na concentração de 4M e
em pH 7,5. A interação do ssDNA (50b-poliA) foi detectada pelo nanoporo através de
bloqueios na corrente iônica. As constantes cinéticas de interação ssDNA-nanoporo foram
determinadas da análise de pelo menos um milhão de bloqueios de corrente. A adição de
glicerol no meio aquoso do nanoporo diminuiu significativamente a condutância do nanoporo
e condutividade da solução dos íons de Hofmeister. Por outro lado aumentou a viscosidade
das soluções dos íons de Hofmeister, principalmente no caso do fluoreto de potássio. O
fluoreto de potássio aumentou em aproximadamente 15%, o tempo de residência do ssDNA
no nanoporo. Deste modo o aumento na viscosidade juntamente com os íons de Hofmeister,
especificamente o fluoreto de potássio, aumenta a sensibilidade do nanoporo, porém ainda
não o suficiente para discriminação adequada das bases nucleotídicas. / The single protein nanopore formed by alpha-toxin of Staphylococcus aureus may be used as
molecular recognition element in the development of biosensors, mass spectrometer and DNA
sequencers. Generally the process of molecular recognition occurs through analyte-nanopore
interaction due to input or permeation of single molecules in the aqueous lumen of the
nanopore. The presence of a molecule inner of the nanopore causes changes in the ionic
current. The analysis of the time series comprises the changes discretized functions as
"imprint" of the occupier or permeant molecule in nanopore. The high speed of DNA
translocation through the nanopore is still a difficulty for accurate and reliable sequencing of
these molecules. In this study was evaluated how the increase in viscosity and the presence of
ions of the Hofmeister series in the aqueous environment influence the DNA–nanopore
interaction, aiming to find better conditions that favor to detect of each nucleotides. Solventfree
planar bilayer lipid membranes, with a capacitance of 40pF, were formed by the lipid
monolayer apposition technique, using DPhPC in hexane. The elevated KCl concentrations
considerably improve single molecule identification by unitary protein nanopores, in this
study membrane-bathing solutions contained 4M halide in 5mM TRIS adjusted to pH 7.5 with
citric acid. The addition of glycerol in the aqueous environment of the nanopore significantly
decreased the channel conductance and conductivity of the solution of Hofmeister ions.
Furthermore, the increased viscosity of solutions of the Hofmeister ions, especially in the case
of potassium fluoride. The potassium fluoride was increased by approximately 15% of the
residence time the ssDNA into nanopore. Thus, the increase in viscosity with Hofmeister ions,
especially potassium fluoride, increases the sensitivity of the nanopore, but still not enough
for adequate discrimination of nucleotide bases.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufpe.br:123456789/17459 |
| Date | 24 July 2014 |
| Creators | AGUIAR, Juliana Pereira de |
| Contributors | RODRIGUES, Cláudio Gabriel |
| Publisher | Universidade Federal de Pernambuco, Programa de Pos Graduacao em Inovacao Terapeutica, UFPE, Brasil |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Breton |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPE, instname:Universidade Federal de Pernambuco, instacron:UFPE |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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