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Previous issue date: 2013-07-05 / FACEPE / Numa ectomicorriza, a fase pré-simbiótica é um período crucial na determinação da compatibilidade entre o fungo e o seu hospedeiro vegetal para o sucesso e estabelecimento da simbiose. Embora a associação tenha sido amplamente documentada do ponto de vista funcional/ecológico, informações acerca dos genes/proteínas envolvidos no início da interação ainda são escassas. O gene PtSRP é sobrexpresso entre 6-12h do pré-contato entre Pisolithus tinctorius-Castanea sativa e estudos in silico demonstraram que sua proteína apresenta região inicial hidrofóbica transmembranar em alfa-hélice seguida de seis fitas-beta intercaladas por loops. Por essas características foi especulado que esse peptídeo (127 a.a e 13,969 kDa) poderia estar relacionado à sinalização/controle das fases iniciais de formação/desenvolvimento da simbiose. Este trabalho objetivou a clonagem da ORF, expressão e purificação da PtSRP e a produção de anticorpos policlonais anti-PtSRP para serem usados na imunolocalização da proteína em P. tinctorius. A ORF mais provável do PtSRP foi amplificada por PCR com o uso de iniciadores adicionados de sítios de restrição para EcoR1 e Xho1. Os fragmentos foram clonados em vetor comercial pJET1.2 e a ORF subclonada em vetor de expressão pET21D(+), previamente tratado com as respectivas enzimas. Essa nova construção do vetor foi utilizada para transformar bactérias de expressão BL-21 Star. A PtSRP foi então expressa em larga escala sob ação do indutor IPTG a 0,1 mM e purificada com e sem o uso de ureia. As proteínas purificadas foram utilizadas na produção de anticorpos anti-PtSRP, em coelhos Oryctolagus curiculus, imunizados com quatro pulsos de 150μg da PtSRP. Após a sangria total, o soro foi coletado, os anticorpos purificados e testados quanto à sensibilidade e especificidade no reconhecimento da PtSRP por western blot. A partir do microcultivo em lâmina de P. tinctorius, o micélio foi submetido aos testes de imunolocalização com uso de anticorpos primários conformacionais anti-PtSRP obtidos nos ensaios anteriores e os anticorpos secundários Alexa Fluor 488 nm Goat anti-rabbit IgG. Para o controle negativo o micélio foi incubado na ausência do anticorpo primário anti-PtRSP. Na imunofluorescência convencional, o micélio foi observado em microscópio Leica DMI 4000B/objetiva 63x e os campos analisados foram escolhidos de acordo com a dispersão/morfologia das hifas, sendo as imagens capturadas e digitalizadas pelo acoplamento de um computador à câmera digital do microscópio. Na microscopia confocal as imagens foram adquiridas com objetiva de 63x/laser 488nm/ óleo de imersão, sendo capturadas e digitalizadas através do acoplamento de computador à câmera digital do microscópio Leica TCS SP2. Os resultados de expressão em sistema procarioto demonstraram que o peptídeo possui massa de 16 kDa o que confirmou as análises de predição anteriores. Na microscopia de fluorescência convencional houve forte marcação da PtSRP ao longo de toda a hifa, especialmente na região correspondente à membrana. A microscopia confocal identificou a marcação da PtSRP principalmente na periferia da hifa, mais especificamente na região correspondente à parede celular/membrana, inclusive no grampo de conexão (estrutura típica dos Basidiomycota). Esses achados coincidem com propriedades de outras proteínas fúngicas envolvidas na formação e reconhecimento das ectomicorrizas (SRAPs e hidrofobinas) que têm localização membranar. Estudos adicionais como nocaute gênico ou utilização de RNAs de interferência serão fundamentais para melhor compreensão do papel fisiológico da PtSRP na simbiose ectomicorrízica. / In ectomycorrhiza, the pre-symbiotic period is crucial to determine the compatibility between the fungus and its host plant for the success and establishment of symbiosis. Although the association is widely documented, information about the genes/proteins involved in the early period interaction are still missing. The PtSRP gene is overexpressed 6-12h of pre-contact between Pisolithus tinctorius-Castanea sativa and in silico studies have shown that PtSRP protein present a initial region hydrophobic transmembrane in alpha-helix followed by a six-sheet interspersed by loops . For these characteristics it has been speculated that this peptide (127 aa and 13,969 kDa) could be related to signaling/control of the early stages of symbiosis development. This work aimed to clone the ORF, to express and purify the PtSRP as well the polyclonal anti-PtSRP production for use in P. tinctorius protein immunolocalization. The most PtSRP ORF was amplified by PCR using primers with restriction sites (Xho1 and EcoR1). The amplified fragments were cloned into pJET1.2 vector and the ORF was subcloned into pET21D (+)expression vector previously treated with these respective enzymes. This new vector was used to transform BL-21 Star bacterial expression. The PtSRP was then expressed in large scale under the action of inductor 0.1 mM IPTG and purified with and without the use of urea. The purified proteins were used to produce antibodies PtSRP, in Oryctolagus curiculus rabbits immunized with four pulses of 150μg PtSRP. After total bleeding, the serum was collected, and purified antibodies tested for their sensitivity and specificity in recognition of PtSRP by western blot. From the P. tinctorius microculture, the mycelium was submited to immunolocalization tests using primary conformational-antibodies anti- PtSRP obtained in previous trials and the secondary antibodies Alexa Fluor 488 nm goat anti-rabbit IgG. For the negative control the mycelium was incubated in the absence of primary anti-PtRSP. In conventional immunofluorescence, the mycelium was observed in a 4000B/objetiva 63x Leica DMI and the analyzed fields were chosen according to the morphology of hyphae, and the images were captured and digitized by coupling a computer to a microscope digital camera. In confocal microscopy images were acquired with the objective 63x/laser 488nm / immersion oil being captured and digitized by coupling a computer to a Leica TCS SP2 microscop digital camera. The results in the prokaryotic expression system showed that the peptide has a mass of 16 kDa which confirm earlier prediction analyzes. In conventional fluorescence microscopy there was a strong marking PtSRP throughout the hyphae, especially in the membrane region. Confocal microscopy identified marking PtSRP mainly in the periphery of hyphae, and more specifically the region corresponding to the cell wall / membrane, including the clamp connection (typical structure of Basidiomycota). These findings are consistent with properties of other fungal proteins involved in the formation and recognition of ectomycorrhizal (SRAPs and hydrophobins) that have membrane localization. Additional studies such as gene knockout or use of interfering RNAs are essential for better understanding of the physiological role of PtSRP in ectomycorrhizal symbiosis.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufpe.br:123456789/17468 |
| Date | 05 July 2013 |
| Creators | VIEIRA, Helder Elísio Evangelista |
| Contributors | MAIA, Leonor Costa |
| Publisher | Universidade Federal de Pernambuco, Programa de Pos Graduacao em Ciencias Biologicas, UFPE, Brasil |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Breton |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPE, instname:Universidade Federal de Pernambuco, instacron:UFPE |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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